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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR
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G号糖

木虫 (正式写手)

[求助] 荧光定量PCR 已有3人参与

最近要做某细菌的一个基因相对表达量，采用荧光定量pcr，现在有点搞不清楚的是先提取总RNA，然后买试剂盒的时候买的一步法RT-PCR试剂盒，我看它的说明书是先进行CDNA合成，然后进行pcr扩增。这样做的话产物是什么呢？反应中要我加的引物是我针对该基因序列设计出来的引物吗？那后续做荧光定量pcr时所加的模板就是前面做出来的pcr产物吗？引物还是加这个基因的特异性引物？
     才接触这块，请多多指教，谢谢
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1楼 2016-05-12 14:59:38
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
G号糖: 金币+2, ★有帮助 2016-05-12 16:03:04
G号糖: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-05-12 17:12:13
RT-PCR和RT-qPCR是有区别的。想做荧光定量PCR需要加入类似sybr green的染料。看楼主的描述似乎不是荧光定量。cDNA加入引物扩增出来是目的片段，若是做荧光定量的时候，加入的模板也是cDNA。
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
2楼2016-05-12 15:05:25
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主
引用回帖:
5楼: Originally posted by G号糖 at 2016-05-12 17:07:15
那就是买的这个试剂盒并不适合，得买RNA转录的试剂盒？...

我们做荧光定量的时候会用专门的逆转录试剂盒，很少会用这种一步法
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
6楼2016-05-12 18:02:31
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chaperonesy

新虫 (小有名气)
我们一般也都是先提取总RNA，然后反转，以cDNA为模板做q-PCR

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9楼2016-05-13 13:52:23
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wx3280065

银虫 (小有名气)
cDNA合成就是反转录的过程，你会发现试剂盒中会给你提供oligo dt和随机六聚体引物，oligo dt为一段特殊的多聚t引物，可以特异的结合到mRNA的poly a上，所以用oligo dt反转录出来的产物为mRNA对应的cDNA，随机引物则会将总RNA反转录出来。推荐你多看看分子克隆这本书。此外RT-PCR为反转录PCR而荧光定量PCR为RT-qPCR,rt-qpcr和反转录的过程是独立的两个实验，首先将RNA反转录为cDNA然后在以合成的cDNA为模版做qPCR

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14楼2016-05-14 20:10:10
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G号糖

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by xuewenfeng at 2016-05-13 16:59:22
我也做这个，但是反转录之后，做DNA验证的时候，做不出来，或者只有几个出来，怎么办？...

你是怎么做DNA验证呢？
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18楼2016-05-15 19:36:29
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普通回帖

G号糖

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangranjun at 2016-05-12 15:05:25
RT-PCR和RT-qPCR是有区别的。想做荧光定量PCR需要加入类似sybr green的染料。看楼主的描述似乎不是荧光定量。cDNA加入引物扩增出来是目的片段，若是做荧光定量的时候，加入的模板也是cDNA。

我是要做荧光定量，在这之前不是要将提出来的RNA反转录吗？以反转录之后的产物cDNA为模板进行qPCR对吧？
现在不明白的是这个一步法RT-PCR试剂盒，现将RNA反转录，再立即进行pcr扩增，这样做出来之后还是我做q-PCR需要的模板了吗？
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3楼2016-05-12 15:23:04
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by G号糖 at 2016-05-12 15:23:04
我是要做荧光定量，在这之前不是要将提出来的RNA反转录吗？以反转录之后的产物cDNA为模板进行qPCR对吧？
现在不明白的是这个一步法RT-PCR试剂盒，现将RNA反转录，再立即进行pcr扩增，这样做出来之后还是我做q-PCR ...

PCR扩增以后就不能再作为q-PCR的模板了。q-PCR的模板是RNA逆转录后的产物。
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
4楼2016-05-12 16:55:20
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G号糖

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wangranjun at 2016-05-12 16:55:20
PCR扩增以后就不能再作为q-PCR的模板了。q-PCR的模板是RNA逆转录后的产物。...

那就是买的这个试剂盒并不适合，得买RNA转录的试剂盒？
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5楼2016-05-12 17:07:15
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邹忌

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先提取RNA ，再做反转录，利用Cdna做实时定量PCR
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不是不能，只是不想
7楼2016-05-12 18:12:56
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star013

新虫 (知名作家)
我们可以提供qpcr和荧光定量服务，价格优惠

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8楼2016-05-13 09:47:25
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xuewenfeng

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by star013 at 2016-05-13 09:47:25
我们可以提供qpcr和荧光定量服务，价格优惠

我也做这个，但是反转录之后，做DNA验证的时候，做不出来，或者只有几个出来，怎么办？
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10楼2016-05-13 16:59:22
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