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G号糖

木虫 (正式写手)

[求助] 荧光定量PCR 已有3人参与

最近要做某细菌的一个基因相对表达量,采用荧光定量pcr,现在有点搞不清楚的是先提取总RNA,然后买试剂盒的时候买的一步法RT-PCR试剂盒,我看它的说明书是先进行CDNA合成,然后进行pcr扩增。这样做的话产物是什么呢?反应中要我加的引物是我针对该基因序列设计出来的引物吗?那后续做荧光定量pcr时所加的模板就是前面做出来的pcr产物吗?引物还是加这个基因的特异性引物?
     才接触这块,请多多指教,谢谢
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G号糖

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wangranjun at 2016-05-12 15:05:25
RT-PCR和RT-qPCR是有区别的。想做荧光定量PCR需要加入类似sybr green的染料。看楼主的描述似乎不是荧光定量。cDNA加入引物扩增出来是目的片段,若是做荧光定量的时候,加入的模板也是cDNA。

我是要做荧光定量,在这之前不是要将提出来的RNA反转录吗?以反转录之后的产物cDNA为模板进行qPCR对吧?
现在不明白的是这个一步法RT-PCR试剂盒,现将RNA反转录,再立即进行pcr扩增,这样做出来之后还是我做q-PCR需要的模板了吗?
3楼2016-05-12 15:23:04
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

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【答案】应助回帖

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G号糖: 金币+2, 有帮助 2016-05-12 16:03:04
G号糖: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-05-12 17:12:13
RT-PCR和RT-qPCR是有区别的。想做荧光定量PCR需要加入类似sybr green的染料。看楼主的描述似乎不是荧光定量。cDNA加入引物扩增出来是目的片段,若是做荧光定量的时候,加入的模板也是cDNA。
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
2楼2016-05-12 15:05:25
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

引用回帖:
3楼: Originally posted by G号糖 at 2016-05-12 15:23:04
我是要做荧光定量,在这之前不是要将提出来的RNA反转录吗?以反转录之后的产物cDNA为模板进行qPCR对吧?
现在不明白的是这个一步法RT-PCR试剂盒,现将RNA反转录,再立即进行pcr扩增,这样做出来之后还是我做q-PCR ...

PCR扩增以后就不能再作为q-PCR的模板了。q-PCR的模板是RNA逆转录后的产物。
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
4楼2016-05-12 16:55:20
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G号糖

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by wangranjun at 2016-05-12 16:55:20
PCR扩增以后就不能再作为q-PCR的模板了。q-PCR的模板是RNA逆转录后的产物。...

那就是买的这个试剂盒并不适合,得买RNA转录的试剂盒?
5楼2016-05-12 17:07:15
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