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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR
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xuewenfeng

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by chaperonesy at 2016-05-13 13:52:23
我们一般也都是先提取总RNA，然后反转，以cDNA为模板做q-PCR

有时候反转之后，DNA 验证结果不好，怎么办
？是什么原因呢？
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11楼2016-05-13 17:00:33
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lingyuaa

新虫 (小有名气)
楼主你好，一步法RT–PCR，就是，加入

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12楼2016-05-14 19:05:02
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lingyuaa

新虫 (小有名气)
提取的总RNA然后PCR，得到的产物直接是DNA

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13楼2016-05-14 19:06:09
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wx3280065

银虫 (小有名气)
cDNA合成就是反转录的过程，你会发现试剂盒中会给你提供oligo dt和随机六聚体引物，oligo dt为一段特殊的多聚t引物，可以特异的结合到mRNA的poly a上，所以用oligo dt反转录出来的产物为mRNA对应的cDNA，随机引物则会将总RNA反转录出来。推荐你多看看分子克隆这本书。此外RT-PCR为反转录PCR而荧光定量PCR为RT-qPCR,rt-qpcr和反转录的过程是独立的两个实验，首先将RNA反转录为cDNA然后在以合成的cDNA为模版做qPCR

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14楼2016-05-14 20:10:10
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804371539

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by chaperonesy at 2016-05-13 13:52:23
我们一般也都是先提取总RNA，然后反转，以cDNA为模板做q-PCR

请问荧光定量的引物有什么设计 啊
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15楼2016-05-14 20:59:51
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小鱼于abc

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
15楼: Originally posted by 804371539 at 2016-05-14 20:59:51
请问荧光定量的引物有什么设计 啊...

荧光定量的引物，你可以参照国外现成的论文里的引物，或者通过软件自己设计，但设计之后要验证特异性的，具体步骤网上都可以找到的

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16楼2016-05-15 08:09:20
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G号糖

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 小鱼于abc at 2016-05-15 08:09:20
荧光定量的引物，你可以参照国外现成的论文里的引物，或者通过软件自己设计，但设计之后要验证特异性的，具体步骤网上都可以找到的
...

那请问q-pcr中需要内参基因，一般做细菌可以用什么内参基因啊
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17楼2016-05-15 19:31:06
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G号糖

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by xuewenfeng at 2016-05-13 16:59:22
我也做这个，但是反转录之后，做DNA验证的时候，做不出来，或者只有几个出来，怎么办？...

你是怎么做DNA验证呢？
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18楼2016-05-15 19:36:29
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小鱼于abc

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by G号糖 at 2016-05-15 19:31:06
那请问q-pcr中需要内参基因，一般做细菌可以用什么内参基因啊...

因为我不是做微生物的所以不太懂，但是内参是一种在你测的东西中稳定表达的，这样用来跟目的基因对比表达量的，如果有这方面的论文你就可以直接参照了

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19楼2016-05-16 06:57:18
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G号糖

木虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 小鱼于abc at 2016-05-16 06:57:18
因为我不是做微生物的所以不太懂，但是内参是一种在你测的东西中稳定表达的，这样用来跟目的基因对比表达量的，如果有这方面的论文你就可以直接参照了
...

好的，谢谢

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20楼2016-05-16 08:47:42
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