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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 关于酶的纯化倍数
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 关于酶的纯化倍数 已有1人参与

最近整理数据，有一部分数据我无法理解不知道是不是测错了，恳请大神指导。
  我做的酶纯化前及纯化后，用的Ni柱，纯化前粗酶20mL，过柱后5个咪唑浓度各收集了2mL，其中3个浓度梯度洗脱组分都有我的目的蛋白条带，100mmol/L这个浓度几乎没有杂带，于是我选了这个浓度洗脱的酶做了酶活。
  按我的理解，既然20ml变成了100浓度梯度的2ml，那么已经浓缩了10倍吧。但是我测纯化前粗酶比活588，纯化后粗酶比活760，纯化倍数才1.3倍。跟10倍也相差太远了，是我哪步数据测定出了问题吗？？！！

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1楼 2016-05-09 00:37:12
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
忘了说了，做酶活前已经定量了，纯化前后用于反应体系的蛋白量是一样的，都是0.2mg。

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2楼2016-05-09 00:43:16
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
各位大神周一开始工作了没呀~拜托给看看啦~

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3楼2016-05-09 08:13:37
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ggyy0911: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 金币双手送上，希望以后能多向您请教~ 2016-05-10 13:45:28
需要除掉咪唑。。。。。，有吗？
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4楼2016-05-09 08:59:04
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xuweitao at 2016-05-09 08:59:04
需要除掉咪唑。。。。。，有吗？

除了，用的Millipore的超滤管
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5楼2016-05-09 09:51:43
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ggyy0911 at 2016-05-09 09:51:43
除了，用的Millipore的超滤管...

你的粗酶比活是什么定义？
单位粗酶量的活性？那样跟浓度没有一毛钱关系。
还是单位体积酶液的活性？那你就得测酶液的浓度了？上柱的效率不一定高，另外你的目标蛋白还分摊在好几个洗脱管里头。
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6楼2016-05-09 10:36:18
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
不好意思，发现你之前的补充说明了。
粗酶用量一样的话，那就取决于你的酶在原有粗酶液中的比例了，比例很高（过表达）的情况下，提纯蛋白对比酶活的提高是有限的啦。（比方说你原来粗酶液中目标蛋白已经占了75%，你发现纯化系数才1.3倍就是完全正常的）
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7楼2016-05-09 10:41:35
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xuweitao at 2016-05-09 10:41:35
不好意思，发现你之前的补充说明了。
粗酶用量一样的话，那就取决于你的酶在原有粗酶液中的比例了，比例很高（过表达）的情况下，提纯蛋白对比酶活的提高是有限的啦。（比方说你原来粗酶液中目标蛋白已经占了75%， ...

嗯嗯，谢谢~~
  我刚刚还意识到，我用的可是Millipore超滤啊，这个本身就有很强的浓缩作用了，不过我最后怕损失太多，我加量洗了好几次，2mL的纯化蛋白液本来应该是50ul，我足足洗出了400ul，即便这样也又浓缩了5倍。
  我的目的酶在粗酶里，看SDS-PAGE的结果占比并不是很高，不过过超滤管的时候几乎只有单一条带了，不图浓缩，就图用这个除盐的。因为我蛋白含量很高……
  有没有可能是我酶失活了一部分，导致后来测定的总酶活降低，所以纯化后的比活力也降低了呢？（但是这样就得是酶虽然失活，可是酶本身作为蛋白还在的情况……）
  重新表达得从头来，-80冻存的酶活不如新鲜的，我现在就纠结我这数据到底能用吗……
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8楼2016-05-09 13:03:54
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ggyy0911 at 2016-05-09 13:03:54
嗯嗯，谢谢~~
  我刚刚还意识到，我用的可是Millipore超滤啊，这个本身就有很强的浓缩作用了，不过我最后怕损失太多，我加量洗了好几次，2mL的纯化蛋白液本来应该是50ul，我足足洗出了400ul，即便这样也又浓缩了5 ...

当然你说的情况是有可能的，蛋白部分失活了。 另外也有一种可能是纯化过程中某些辅因子丢失了。可能原来粗酶液里可能有这些游离的辅因子，也可能是结合在蛋白上的辅因子在超滤稀释时透膜丢失了。不了解你的酶属于哪类酶，估计你得看看酶的作用机理。
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9楼2016-05-10 08:23:44
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xuweitao at 2016-05-10 08:23:44
当然你说的情况是有可能的，蛋白部分失活了。 另外也有一种可能是纯化过程中某些辅因子丢失了。可能原来粗酶液里可能有这些游离的辅因子，也可能是结合在蛋白上的辅因子在超滤稀释时透膜丢失了。不了解你的酶属于哪 ...

我觉得您太牛了~
  那我能不能顺便厚脸皮的再追问一下，我这个酶，活性中心有个Zn2+，有文献报道的，也是说Zn强催化，二价铁和三价铁是抑制活性的，但我后期做离子影响的时候发现，5mM的时候和文献报道相符，10mM离子浓度的时候，Zn还是最强的，但二价三价铁已经有增强酶活的趋势了。等增强到30mM以上，二价铁三价铁变成强催化了，相对活性都到了1.4, 1.6。Zn反而只有1.02这样了。这是没有任何文献报道过的，我这酶结构还没解析，同源性高的酶晶体解析里也没提到过其他离子。
  不知道你对这种现象有什么看法吗？能不能教教我，或者讨论讨论~~
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10楼2016-05-10 13:23:25
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