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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 关于酶的纯化倍数 已有1人参与

最近整理数据,有一部分数据我无法理解不知道是不是测错了,恳请大神指导。
  我做的酶纯化前及纯化后,用的Ni柱,纯化前粗酶20mL,过柱后5个咪唑浓度各收集了2mL,其中3个浓度梯度洗脱组分都有我的目的蛋白条带,100mmol/L这个浓度几乎没有杂带,于是我选了这个浓度洗脱的酶做了酶活。
  按我的理解,既然20ml变成了100浓度梯度的2ml,那么已经浓缩了10倍吧。但是我测纯化前粗酶比活588,纯化后粗酶比活760,纯化倍数才1.3倍。跟10倍也相差太远了,是我哪步数据测定出了问题吗??!!

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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by xuweitao at 2016-05-10 08:23:44
当然你说的情况是有可能的,蛋白部分失活了。 另外也有一种可能是纯化过程中某些辅因子丢失了。可能原来粗酶液里可能有这些游离的辅因子,也可能是结合在蛋白上的辅因子在超滤稀释时透膜丢失了。不了解你的酶属于哪 ...

我觉得您太牛了~
  那我能不能顺便厚脸皮的再追问一下,我这个酶,活性中心有个Zn2+,有文献报道的,也是说Zn强催化,二价铁和三价铁是抑制活性的,但我后期做离子影响的时候发现,5mM的时候和文献报道相符,10mM离子浓度的时候,Zn还是最强的,但二价三价铁已经有增强酶活的趋势了。等增强到30mM以上,二价铁三价铁变成强催化了,相对活性都到了1.4, 1.6。Zn反而只有1.02这样了。这是没有任何文献报道过的,我这酶结构还没解析,同源性高的酶晶体解析里也没提到过其他离子。
  不知道你对这种现象有什么看法吗?能不能教教我,或者讨论讨论~~
10楼2016-05-10 13:23:25
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

忘了说了,做酶活前已经定量了,纯化前后用于反应体系的蛋白量是一样的,都是0.2mg。

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2楼2016-05-09 00:43:16
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

各位大神周一开始工作了没呀~拜托给看看啦~

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3楼2016-05-09 08:13:37
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
ggyy0911: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 金币双手送上,希望以后能多向您请教~ 2016-05-10 13:45:28
需要除掉咪唑。。。。。,有吗?
4楼2016-05-09 08:59:04
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