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构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？ 已有1人参与
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构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？求帮助，50bp左右的两个互补单链引物如何退火形成双链，求具体的程序。 自己在文献查到到的如下，不知道可不可以，有问题吗？ 用ddH2O 稀释引物，使终浓度为100μM。分别吸取10μl 的上下游引物混合并吹打均匀放入PCR 管内进行退火，程序如下： 95℃ 30 s，72℃ 2 min，37℃ 2 min，25℃ 2 min。 请做过的同志们帮帮忙，具体的体系和程序该怎么设定，需要什么离子之类的吗？第一次接触，实验室无相关经验，急切求帮助。 |
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kangaroo0513
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1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体： 载体:---2ul（2-5ug） 酶---------2.5ul Buf--------2.5ul 水---------18ul 回收的时候希望浓度高点。 2. Oligo退火形成双链 若为2OD=5.4nmol的话，则每个引物用54ul水溶解，即得到浓度为100uM（100pmol/ul）的溶液。 取两引物各10ul，10X NEB Buf-2取2.2ul，混匀，PCR仪缓慢退火至室温（>60min）。 程序如下： 95℃--------5min； 94~46℃--降1℃/min 46~26℃--降2℃/min 4℃---------forever 3. linker的5’端磷酸化 退火产物-------------0.5ul (50pmol总5’末端) 10x PNK Buf A-------2ul 10mM ATP------------2ul T4 PNK酶------------1ul ddH2O----------------14.5ul 以上总计20ul，混匀（不可votex），37度30min。 4. 连接 T4 DNA ligase法 酶切过载体----------100-200ng 磷酸化linker--------4ul 1:100稀释后的linker T4 酶------------------1ul T4 Ligase Buf---------1ul PEG4000--------------1ul 加水补足总体积10ul，混匀，4度过夜。 |
3楼2016-05-08 15:07:55
kangaroo0513
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