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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？
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永远一片天

新虫 (正式写手)

[求助] 构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？已有1人参与

构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？求帮助，50bp左右的两个互补单链引物如何退火形成双链，求具体的程序。
自己在文献查到到的如下，不知道可不可以，有问题吗？
用ddH2O 稀释引物，使终浓度为100μM。分别吸取10μl 的上下游引物混合并吹打均匀放入PCR 管内进行退火，程序如下：
95℃ 30 s，72℃ 2 min，37℃ 2 min，25℃ 2 min。
请做过的同志们帮帮忙，具体的体系和程序该怎么设定，需要什么离子之类的吗？第一次接触，实验室无相关经验，急切求帮助。
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1楼2016-05-07 21:28:55
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
永远一片天: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-05-09 21:54:04
我没做过shrna退火，但是做过cas9的gRNA退火，程序这么设置的：
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2楼2016-05-08 15:05:49
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-07-20 07:28:13
1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体：
      载体:---2ul（2-5ug）
      酶---------2.5ul
      Buf--------2.5ul
      水---------18ul
回收的时候希望浓度高点。

2. Oligo退火形成双链
   若为2OD=5.4nmol的话，则每个引物用54ul水溶解，即得到浓度为100uM（100pmol/ul）的溶液。
   取两引物各10ul，10X NEB Buf-2取2.2ul，混匀，PCR仪缓慢退火至室温（>60min）。
   程序如下：
   95℃--------5min；
   94~46℃--降1℃/min
   46~26℃--降2℃/min
   4℃---------forever

3. linker的5’端磷酸化
      退火产物-------------0.5ul (50pmol总5’末端)
      10x PNK Buf A-------2ul
   10mM ATP------------2ul
   T4 PNK酶------------1ul
   ddH2O----------------14.5ul
  以上总计20ul，混匀（不可votex），37度30min。

4. 连接
T4 DNA ligase法
        酶切过载体----------100-200ng
        磷酸化linker--------4ul 1:100稀释后的linker
        T4 酶------------------1ul
        T4 Ligase Buf---------1ul
        PEG4000--------------1ul
       加水补足总体积10ul，混匀，4度过夜。
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3楼2016-05-08 15:07:55
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-08 15:07:55
1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体：
      载体:---2ul（2-5ug）
      酶---------2.5ul
      Buf--------2.5ul
      水---------18ul
回收的时候希望浓度高点。

2. Olig ...

1号是磷酸化后，没有稀释就连入载体的，转化；
2号是磷酸化后，1:100稀释就连入载体的，转化；
3号是酶切后的载体转化；
4号是载体原质粒转化
构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？
退火形成双链连入载体.jpg
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4楼2016-05-08 15:11:53
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永远一片天

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-08 15:07:55
1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体：
      载体:---2ul（2-5ug）
      酶---------2.5ul
      Buf--------2.5ul
      水---------18ul
回收的时候希望浓度高点。

2. Olig ...

你好，我发表了一个求助，你可以帮忙解答一下吗？谢谢啦，你的QQ号是多少？
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5楼2016-05-27 11:59:35
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胡飞燕

新虫 (初入文坛)
有没有人能够告诉我一下，为什么加了T4Ligase后，阻抗急剧变小
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6楼2016-07-19 21:18:53
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苏小拙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-08 15:07:55
1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体：
      载体:---2ul（2-5ug）
      酶---------2.5ul
      Buf--------2.5ul
      水---------18ul
回收的时候希望浓度高点。

2. Olig ...

求教：一定要做5’端磷酸化这一步吗？退火之后直接连接效果会怎么样？
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7楼2018-11-08 10:09:56
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 苏小拙 at 2018-11-08 10:09:56
求教：一定要做5’端磷酸化这一步吗？退火之后直接连接效果会怎么样？...

不一定。如果你载体上有磷，片段就不需要磷酸化。效果可以的。
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8楼2018-11-08 15:24:40
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