| 查看: 12859 | 回复: 7 | |||
[求助]
构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？已有1人参与
|
|
构建shRNA慢病毒，引物退火程序怎么设定？求帮助，50bp左右的两个互补单链引物如何退火形成双链，求具体的程序。 自己在文献查到到的如下，不知道可不可以，有问题吗？ 用ddH2O 稀释引物，使终浓度为100μM。分别吸取10μl 的上下游引物混合并吹打均匀放入PCR 管内进行退火，程序如下： 95℃ 30 s，72℃ 2 min，37℃ 2 min，25℃ 2 min。 请做过的同志们帮帮忙，具体的体系和程序该怎么设定，需要什么离子之类的吗？第一次接触，实验室无相关经验，急切求帮助。 |
回复此楼» 收录本帖的淘贴专辑推荐
 生物科学系列 |
» 猜你喜欢
球磨分散剂
已经有4人回复
-
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有227人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酸接酚羟基，
已经有11人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酰氯
已经有10人回复
-
酸酐或者羧酸酰氯化
已经有15人回复
-
酚羟基接入磷酸，磷酸酯化
已经有26人回复
-
土壤中可溶性有机碳种类
已经有1人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 2015年浙江省医药卫生科技计划拟立项项目公示
已经有3人回复
- 转进去PLKO.1载体的菌长得慢是怎么回事？
已经有0人回复
- 慢病毒制备 制备的病毒滴度很低很低。。。。
已经有7人回复
- ShRNA 慢病毒表达载体的构建和病毒颗粒包装
已经有99人回复
kangaroo0513
新虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 154 (高中生)
- 金币: 2277.4
- 散金: 100
- 红花: 29
- 帖子: 464
- 在线: 119.4小时
- 虫号: 2621902
- 注册: 2013-08-28
- 专业: 细胞物质运输
2楼2016-05-08 15:05:49
kangaroo0513
新虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 154 (高中生)
- 金币: 2277.4
- 散金: 100
- 红花: 29
- 帖子: 464
- 在线: 119.4小时
- 虫号: 2621902
- 注册: 2013-08-28
- 专业: 细胞物质运输
【答案】应助回帖
★
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-07-20 07:28:13
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-07-20 07:28:13
|
1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体： 载体:---2ul（2-5ug） 酶---------2.5ul Buf--------2.5ul 水---------18ul 回收的时候希望浓度高点。 2. Oligo退火形成双链 若为2OD=5.4nmol的话，则每个引物用54ul水溶解，即得到浓度为100uM（100pmol/ul）的溶液。 取两引物各10ul，10X NEB Buf-2取2.2ul，混匀，PCR仪缓慢退火至室温（>60min）。 程序如下： 95℃--------5min； 94~46℃--降1℃/min 46~26℃--降2℃/min 4℃---------forever 3. linker的5’端磷酸化 退火产物-------------0.5ul (50pmol总5’末端) 10x PNK Buf A-------2ul 10mM ATP------------2ul T4 PNK酶------------1ul ddH2O----------------14.5ul 以上总计20ul，混匀（不可votex），37度30min。 4. 连接 T4 DNA ligase法 酶切过载体----------100-200ng 磷酸化linker--------4ul 1:100稀释后的linker T4 酶------------------1ul T4 Ligase Buf---------1ul PEG4000--------------1ul 加水补足总体积10ul，混匀，4度过夜。 |
3楼2016-05-08 15:07:55
kangaroo0513
新虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 154 (高中生)
- 金币: 2277.4
- 散金: 100
- 红花: 29
- 帖子: 464
- 在线: 119.4小时
- 虫号: 2621902
- 注册: 2013-08-28
- 专业: 细胞物质运输
4楼2016-05-08 15:11:53
5楼2016-05-27 11:59:35
6楼2016-07-19 21:18:53
7楼2018-11-08 10:09:56
kangaroo0513
新虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 154 (高中生)
- 金币: 2277.4
- 散金: 100
- 红花: 29
- 帖子: 464
- 在线: 119.4小时
- 虫号: 2621902
- 注册: 2013-08-28
- 专业: 细胞物质运输
8楼2018-11-08 15:24:40
10