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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Millipore超滤离心管浓缩纯化后的蛋白质
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落木778

铜虫 (小有名气)

[求助] Millipore超滤离心管浓缩纯化后的蛋白质 已有4人参与

请教各位大神，我的目的蛋白是携带GST标签的，分子量大约40KDa，使用Millipore超滤离心管浓缩，规格4ml , 10KDa；4℃，4000rpm,10min离心后约摸剩下200ul浓缩后的蛋白，然后进行BCA浓度测定，发现浓缩后的蛋白的浓度比将废弃的液体的蛋白浓度还要低，迷惑了，请求分析与帮助！！！
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1楼 2016-05-02 15:03:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

moychan

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
6楼: Originally posted by 落木778 at 2016-05-03 10:42:06
请问你平时用哪种方法进行蛋白浓缩？...

透析袋浓缩，或冷冻干燥

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8楼2016-05-03 20:48:15
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

应该是膜破了，缩短离心时间到1-2分钟，如果一样大部分都滤过去了，肯定是漏。 换个管吧，另外考虑是不是转速过高了，看你转子大小了，3000g以内的离心力应该没问题。
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10楼2016-05-06 09:39:09
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普通回帖

aoda123

木虫 (正式写手)
是不是转速大，离心管的滤膜破了？

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身体健康，工作顺利
2楼2016-05-02 22:26:44
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moychan

银虫 (小有名气)
换一种方法吧，这种方法本身就有很大的损失

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3楼2016-05-02 22:47:01
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虫虫笑了

木虫 (小有名气)
是不是小于目的蛋白的杂蛋白量很大呢，一旦过滤之后，大部分的杂蛋白被分离出去，剩下的蛋白虽然体积小了，但是浓度也不会很高
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1111
4楼2016-05-03 09:15:32
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落木778

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 虫虫笑了 at 2016-05-03 09:15:32
是不是小于目的蛋白的杂蛋白量很大呢，一旦过滤之后，大部分的杂蛋白被分离出去，剩下的蛋白虽然体积小了，但是浓度也不会很高

浓缩之前，跑PAGE验证了，单一的目的蛋白条带。
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5楼2016-05-03 10:41:23
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落木778

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by moychan at 2016-05-02 22:47:01
换一种方法吧，这种方法本身就有很大的损失

请问你平时用哪种方法进行蛋白浓缩？
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6楼2016-05-03 10:42:06
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落木778

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aoda123 at 2016-05-02 22:26:44
是不是转速大，离心管的滤膜破了？

请问用什么方法可以检测离心管的滤膜是否完整？
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7楼2016-05-03 10:42:55
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pursuream

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 落木778 at 2016-05-03 10:42:55
请问用什么方法可以检测离心管的滤膜是否完整？...

你的4000rpm对应多少g？初始体积有多少？转速似乎有些高。我一般用到3000 rpm, 约2000 g。你可以试试超滤荧光蛋白，看下面有无荧光。

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9楼2016-05-06 01:04:06
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