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小李子冲奥

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR木有条带 求解!!! 已有1人参与

第一次的体系:30ul    cDNA的260/280:1.60

Taq pcr mix                          15ul
ddH2O                     8.6ul
F(10uM)               1.2ul
R(10uM)               1.2ul
cDNA(1200ug/ul)   4ul

95摄氏度       2min

95摄氏度       30s
50摄氏度       30s
72摄氏度       1min
重复34次

72摄氏度        10min
4度保存

跑胶用1.2%的琼脂凝胶
条带如下(最左和最右是10000bp的marker):
PCR木有条带 求解!!!


第二次的体系:30ul    cDNA的260/280:1.61

金牌 mix                    27ul
F(10uM)                  1ul
R(10uM)                  1ul
cDNA(1200ug/ul)   1.2ul

98摄氏度       2min

98摄氏度       10s
55摄氏度       10s
72摄氏度       1min
重复30次

72摄氏度        5min
4度保存

跑胶用1%的琼脂凝胶
条带如下 (最右6个是我的样):
PCR木有条带 求解!!!-1

两次都没有条带 送公司也反馈木有条带 请问大家是问什么?哪一步有问题?
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fengjunchen

铜虫 (小有名气)

你的图……引物二聚体都没有,确定引物没啥问题吗?
RT-PCR,一般会有内参组的,内参也是图中那样啥也没有吗?
7楼2016-04-29 16:32:10
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天机哥哥

禁虫 (小有名气)

感谢参与,应助指数 +1
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2楼2016-04-28 20:52:41
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小李子冲奥

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 天机哥哥 at 2016-04-28 20:52:41
问题很多,首先CDNA260/280正常值应该在1.8左右,1.6的话有点问题,其次是你的CDNA浓度过大,1200ug/ul?PCR要跑这么多CDNA,我也是第一次见,一般CDNA浓度稀释到50ng/ul,30ul体系也就取1ul足矣,再者,你的PCR条件设 ...

谢谢大神 起初我也觉得dna的质量有点弱 浓度倒是没有考虑过 我第一次pcr阔增的片段大概2000bp左右 第二次大概都是600左右 退火温度是根据公司反馈的数据取得平均值 不知道持续时间怎么定?

发自小木虫IOS客户端
3楼2016-04-29 10:35:34
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天机哥哥

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

4楼2016-04-29 12:27:06
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