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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR木有条带 求解！！！
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小李子冲奥

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR木有条带 求解！！！ 已有1人参与

第一次的体系：30ul    cDNA的260/280:1.60

Taq pcr mix                          15ul
ddH2O                     8.6ul
F（10uM）               1.2ul
R（10uM）               1.2ul
cDNA（1200ug/ul）   4ul

95摄氏度       2min

95摄氏度       30s
50摄氏度       30s
72摄氏度       1min
重复34次

72摄氏度        10min
4度保存

跑胶用1.2%的琼脂凝胶
条带如下（最左和最右是10000bp的marker）：
PCR木有条带 求解！！！


第二次的体系：30ul    cDNA的260/280:1.61

金牌 mix                    27ul
F（10uM）                  1ul
R（10uM）                  1ul
cDNA（1200ug/ul）   1.2ul

98摄氏度       2min

98摄氏度       10s
55摄氏度       10s
72摄氏度       1min
重复30次

72摄氏度        5min
4度保存

跑胶用1%的琼脂凝胶
条带如下 （最右6个是我的样）：
PCR木有条带 求解！！！-1

两次都没有条带 送公司也反馈木有条带 请问大家是问什么?哪一步有问题？
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1楼 2016-04-28 20:10:27
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天机哥哥

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
2楼2016-04-28 20:52:41
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小李子冲奥

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 天机哥哥 at 2016-04-28 20:52:41
问题很多，首先CDNA260/280正常值应该在1.8左右，1.6的话有点问题，其次是你的CDNA浓度过大，1200ug/ul?PCR要跑这么多CDNA，我也是第一次见，一般CDNA浓度稀释到50ng/ul,30ul体系也就取1ul足矣，再者，你的PCR条件设 ...

谢谢大神 起初我也觉得dna的质量有点弱 浓度倒是没有考虑过 我第一次pcr阔增的片段大概2000bp左右 第二次大概都是600左右 退火温度是根据公司反馈的数据取得平均值 不知道持续时间怎么定？

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3楼2016-04-29 10:35:34
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天机哥哥

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
4楼2016-04-29 12:27:06
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小李子冲奥

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 天机哥哥 at 2016-04-29 12:27:06
总RNA你最好重提下，保证260/280在1.9到2.0,260/230大于2，取一定量的RNA反转录为CDNA，保持CDNA的终浓度在50ng/ul，退火温度一般根据你设计的引物Tm值而定，Tm是多少，退火温度就是多少，一般像Primer 3等软件设计 ...

好的 那我再试试 谢谢大神相助！！
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5楼2016-04-29 15:31:33
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wangbo1942

新虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
6楼2016-04-29 16:13:47
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fengjunchen

铜虫 (小有名气)
你的图……引物二聚体都没有，确定引物没啥问题吗？
RT-PCR，一般会有内参组的，内参也是图中那样啥也没有吗？
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7楼2016-04-29 16:32:10
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小李子冲奥

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by fengjunchen at 2016-04-29 16:32:10
你的图……引物二聚体都没有，确定引物没啥问题吗？
RT-PCR，一般会有内参组的，内参也是图中那样啥也没有吗？

我是按照试剂盒上的反转录完 然后就直接拿cdna为底物做的PCR  没有内参组啊。。。
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8楼2016-04-29 19:56:24
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墨竹韵

金虫 (职业作家)
看回复学习

发自小木虫Android客户端
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9楼2016-05-02 22:36:48
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