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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 半定量
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zfy535251

新虫 (小有名气)

[求助] 半定量 已有1人参与

半定量和RT-半定量有什么区别？半定量是用cDNA用平时普通的pcr仪扩增么？一般程序是什么？还需要用SYBR吗？师兄师姐帮我，问题好多

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1楼 2016-04-22 18:48:11
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
半定量是一种检测基因的表达量的方法，通常设置两个在PCR指数增长期的循环数，以内参基因在低循环的亮度作为参考，通过比较低循环和高循环的目的基因的条带亮度差异来表征基因的表达情况。
半定量所用也应该是cDNA作为模板，用普通R-Taq酶就可以。
一般步骤：提RNA---反转录成cDNA--内参基因设置循环26左右去调整反转录的cDNA的条带亮度一致（跑电泳）--亮度一致后，一般设置26和28/29循环，其中26循环有内参和目的基因，28循环只有目的基因---PCR结束统一电泳---灰度比较表达量。
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2楼2016-04-22 19:35:31
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zfy535251

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-04-22 19:35:31
半定量是一种检测基因的表达量的方法，通常设置两个在PCR指数增长期的循环数，以内参基因在低循环的亮度作为参考，通过比较低循环和高循环的目的基因的条带亮度差异来表征基因的表达情况。
半定量所用也应该是cDNA ...

为什么要设3个不同的循环呢？目的基因和内参的循环数不应该一样吗？

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3楼2016-04-22 19:40:17
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zfy535251

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zfy535251 at 2016-04-22 19:40:17
为什么要设3个不同的循环呢？目的基因和内参的循环数不应该一样吗？
...

还有pcr程序一般是什么呢？

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4楼2016-04-22 19:44:18
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卡维斯

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zfy535251 at 2016-04-22 19:40:17
为什么要设3个不同的循环呢？目的基因和内参的循环数不应该一样吗？
...

28循环或者29循环
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5楼2016-04-22 19:45:32
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by zfy535251 at 2016-04-22 19:44:18
还有pcr程序一般是什么呢？
...

就是正常普通PCR的程序呀。
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6楼2016-04-22 19:46:00
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zfy535251

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-04-22 19:46:00
就是正常普通PCR的程序呀。...

噢噢噢，非常感谢

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7楼2016-04-22 19:48:07
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biotech_zhou

木虫 (著名写手)

待人以诚：专业/专注/专心
原理一样，检测的试剂和仪器不一样······
高品质2×逆转录MIX，操作方便简单，RT反应只需加入模板和水，免费试用申请进行中，有意请PM哦······
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年末优惠荧光定量pcr、WB、ELISA技术服务一律六折！交流锤炼知识，用心构筑桥梁，以更优质的产品及技术服务助力科研；QQ：2513165427；Email：b
8楼2016-04-27 09:35:48
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