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zfy535251

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[求助] 半定量已有1人参与

半定量和RT-半定量有什么区别？半定量是用cDNA用平时普通的pcr仪扩增么？一般程序是什么？还需要用SYBR吗？师兄师姐帮我，问题好多

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1楼 2016-04-22 18:48:11

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卡维斯

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

半定量是一种检测基因的表达量的方法，通常设置两个在PCR指数增长期的循环数，以内参基因在低循环的亮度作为参考，通过比较低循环和高循环的目的基因的条带亮度差异来表征基因的表达情况。
半定量所用也应该是cDNA作为模板，用普通R-Taq酶就可以。
一般步骤：提RNA---反转录成cDNA--内参基因设置循环26左右去调整反转录的cDNA的条带亮度一致（跑电泳）--亮度一致后，一般设置26和28/29循环，其中26循环有内参和目的基因，28循环只有目的基因---PCR结束统一电泳---灰度比较表达量。

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2楼2016-04-22 19:35:31

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zfy535251

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2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-04-22 19:35:31
半定量是一种检测基因的表达量的方法，通常设置两个在PCR指数增长期的循环数，以内参基因在低循环的亮度作为参考，通过比较低循环和高循环的目的基因的条带亮度差异来表征基因的表达情况。
半定量所用也应该是cDNA ...

为什么要设3个不同的循环呢？目的基因和内参的循环数不应该一样吗？

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3楼2016-04-22 19:40:17

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