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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 自己设计的引物，PCR后出现多条带～
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半仙0356

新虫 (正式写手)

[交流] 自己设计的引物，PCR后出现多条带～

自己设计的引物，PCR后电泳出现多条带，引物回来的时候上面标的退火温度不准，怎么破？？？求大神～

自己设计的引物，PCR后出现多条带～


自己设计的引物，PCR后出现多条带～-1


自己设计的引物，PCR后出现多条带～-2


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1楼 2016-04-22 16:40:35
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Miscanthus

铁虫 (初入文坛)
★
半仙0356(金币+1): 谢谢参与
梯度，参考值上下5，那么多非特异带，应该是温度低了

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10楼2016-04-22 21:40:56
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red-bri

新虫 (小有名气)
★
半仙0356(金币+1): 谢谢参与
引物上面只是推荐的，并不能拿来直接做实验的，要先温度梯度预实验的。

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3楼2016-04-22 17:05:30
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段李晓彤

银虫 (正式写手)
★
半仙0356(金币+1): 谢谢参与
我看着换个引物吧，左边两个上样孔亮的有个性

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17楼2016-04-23 06:50:35
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★
半仙0356(金币+1): 谢谢参与
你想扩的目标带多大？怎么会出那么多条带。
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7楼2016-04-22 18:24:28
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半仙0356

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by stone2239 at 2016-04-22 18:24:28
你想扩的目标带多大？怎么会出那么多条带。

我的目标带大概是150左右，我也不知道怎么回出现那么多条带～

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8楼2016-04-22 20:53:31
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半仙0356

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by red-bri at 2016-04-22 17:05:30
引物上面只是推荐的，并不能拿来直接做实验的，要先温度梯度预实验的。

梯度单位怎么确定呢？给的参考值上下三度？？？

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9楼2016-04-22 20:54:16
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
感觉你这个不完全是温度的问题，你把退火温度提高，延伸时间用的多长？150bp的片段20秒应该就够了。还不行的话，建议换引物，可能是你的引物特异性不好。
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11楼2016-04-22 21:47:49
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804371539

铜虫 (小有名气)
★
半仙0356(金币+1): 谢谢参与
做个巢式试试

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12楼2016-04-22 22:35:28
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jingyu90217

新虫 (小有名气)
★
半仙0356(金币+1): 谢谢参与
引物设计的如果没问题（二级结构,GC含量，引物间配对等），就是评论里大家说的要摸Tm梯度。引物合成单回来的上下游温度之和除2减5。然后以这个温度为中间值。上下各隔2度试下。

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13楼2016-04-23 00:56:02
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半仙0356

新虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by jingyu90217 at 2016-04-23 00:56:02
引物设计的如果没问题（二级结构,GC含量，引物间配对等），就是评论里大家说的要摸Tm梯度。引物合成单回来的上下游温度之和除2减5。然后以这个温度为中间值。上下各隔2度试下。
...

谢谢咯O(∩_∩)O

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14楼2016-04-23 06:10:28
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半仙0356

新虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by stone2239 at 2016-04-22 21:47:49
感觉你这个不完全是温度的问题，你把退火温度提高，延伸时间用的多长？150bp的片段20秒应该就够了。还不行的话，建议换引物，可能是你的引物特异性不好。

延伸时间是30秒，

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15楼2016-04-23 06:11:28
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半仙0356

新虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 804371539 at 2016-04-22 22:35:28
做个巢式试试

没做过这个～怎么做呢？

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16楼2016-04-23 06:11:48
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heygod1212

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by jingyu90217 at 2016-04-23 00:56:02
引物设计的如果没问题（二级结构,GC含量，引物间配对等），就是评论里大家说的要摸Tm梯度。引物合成单回来的上下游温度之和除2减5。然后以这个温度为中间值。上下各隔2度试下。
...

我设计了引物，引物的Tm值都是40多一点，50不到，然后△Gm是-20多，将近30怎么办
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18楼2018-07-27 09:18:53
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heygod1212

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by stone2239 at 2016-04-22 18:24:28
你想扩的目标带多大？怎么会出那么多条带。

求大神指导，我设计了引物，引物的Tm值都是40多一点，50不到，然后△Gm是-20多，将近30怎么办比较好
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19楼2018-07-27 09:21:28
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hydzp2楼
2016-04-22 16:48   回复  
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fw_xiao4楼
2016-04-22 17:19   回复  
半仙0356(金币+1): 谢谢参与
qqaoqq5楼
2016-04-22 17:20   回复  
半仙0356(金币+1): 谢谢参与
xhmaohan6楼
2016-04-22 18:11   回复  
半仙0356(金币+1): 谢谢参与
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