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jingyu90217

新虫 (小有名气)

[求助] 双酶切体系一般怎么优化呢 已有4人参与

之前尝试用50微的总体系切5微克的质粒。使用的是takara的kpnI和SalI。一个15U/微。一个10U/微。我就各加了1微。按道理总共可以切25微克的质粒啊。我在37度切了三个半小时。跑胶也是线性的。但是最后转化的假阳性特别高。感觉是酶切不完全造成的。我改如何调整这个酶切体系呢？有的说要在20微里切1微克。有的又说要用100微左右的大体系酶切效果好…我的表达载体是空载质粒。两个酶切位点间隔15bp。应该如何改进双酶切体系呢？？？Orz跪求各路大神解答……

双酶切体系一般怎么优化呢


@biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2016-04-13 01:54:44
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yangdl1023

木虫 (正式写手)

Panggong
一般我们用一个酶会先切过夜，然后回收在用另外个酶切，但现在我们基本用NEB的酶，他们的酶基本有个buffer可以双切，而且takara好像有个都通用的buffer,在国内联系他们，想买还竟然不买，后面就不用他们公司的了
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2楼2016-04-13 13:34:31
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jingyu90217

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangdl1023 at 2016-04-13 13:34:31
一般我们用一个酶会先切过夜，然后回收在用另外个酶切，但现在我们基本用NEB的酶，他们的酶基本有个buffer可以双切，而且takara好像有个都通用的buffer,在国内联系他们，想买还竟然不买，后面就不用他们公司的了

你是分步酶切咯？中间要氯仿抽提吗？

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3楼2016-04-13 14:23:26
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yangdl1023

木虫 (正式写手)

Panggong
引用回帖:
3楼: Originally posted by jingyu90217 at 2016-04-13 14:23:26
你是分步酶切咯？中间要氯仿抽提吗？
...

直接用PCR pure KIT，就好了
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4楼2016-04-13 15:19:29
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jingyu90217

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yangdl1023 at 2016-04-13 15:19:29
直接用PCR pure KIT，就好了...

那你过夜切一般永多大体系呢？100微里面质粒几克合适？

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5楼2016-04-13 15:31:09
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jingyu90217

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jingyu90217 at 2016-04-13 15:31:09
那你过夜切一般永多大体系呢？100微里面质粒几克合适？
...

是几微克质粒。。。打错了……我打算试试切3微克质粒。酶量的话要多加一些吗？

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6楼2016-04-13 15:32:10
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yangdl1023

木虫 (正式写手)

Panggong
引用回帖:
5楼: Originally posted by jingyu90217 at 2016-04-13 15:31:09
那你过夜切一般永多大体系呢？100微里面质粒几克合适？
...

具体的量我们都没测，这么跟你讲吧，一般质粒扩增完，用miniplasmid kit提完，每个柱子用50ul H2O elution. 如果你是做vector的话，应在20 ul,就够了（一般我们用12，你多一步回收，会有损失可以多用点），如果你是insert的话，就按1：3做，我们一般都不会有问题，具体溶度，你可以看一下，一般miniplasmd提出来的溶度范围，应该都差不多，
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7楼2016-04-13 16:25:29
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jingyu90217

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yangdl1023 at 2016-04-13 16:25:29
具体的量我们都没测，这么跟你讲吧，一般质粒扩增完，用miniplasmid kit提完，每个柱子用50ul H2O elution. 如果你是做vector的话，应在20 ul,就够了（一般我们用12，你多一步回收，会有损失可以多用点），如果你是 ...

谢谢啦~~我是要构建植物表达载体。载体本身9.7kb。现在是要双酶切载体跟PCR产物用T4连。（因为片段2900bp一直连不上T载体）今天重新提了空载质粒。定量是180ng/微。我选择过夜切了。总体系100微。加了20微质粒，kpnI和SalI各5微。一会儿睡醒去跑胶……期待有好结果……

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8楼2016-04-14 01:43:17
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yangdl1023

木虫 (正式写手)

Panggong
引用回帖:
8楼: Originally posted by jingyu90217 at 2016-04-14 01:43:17
谢谢啦~~我是要构建植物表达载体。载体本身9.7kb。现在是要双酶切载体跟PCR产物用T4连。（因为片段2900bp一直连不上T载体）今天重新提了空载质粒。定量是180ng/微。我选择过夜切了。总体系100微。加了20微质粒，kp ...

good luck
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9楼2016-04-14 11:31:55
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我一般都是１ＵＬ酶切１ＵＧ质粒的。酶切位点也选那些便宜的酶，这样用起来方便也不费钱．
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采菊东篱下，悠然见南山。
10楼2016-04-14 14:55:00
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