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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 大肠杆菌生长速度快质粒浓度低，怎么破？
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璇玑lexi

新虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌生长速度快质粒浓度低，怎么破？ 已有7人参与

试验出现问题：
多次摇菌，送去测序均显示模板浓度低，无信号。提取质粒后发现浓度很低（100ng/ul左右），而菌液生长速度很快（早8点摇菌，下午2点菌液已浑浊）
1.已经过菌液PCR及质粒PCR均获得目的条带（PCR过程中设置了对照，排除PCR过程中存在问题）
2.开始怀疑是载体的问题，但更换过克隆载体，高拷贝的空载体，不同抗性的载体等，情况依旧没有得到改善（排除载体存在问题）
3.又怀疑是感受态的问题，于是更换了感受态，情况依旧没有改善(且实验室采用的是商业感受态，其他人也用同样的感受态，没有问题）
4.再怀疑是菌活性的问题，但挑取过新鲜的单克隆菌落，也曾使用过测序正确的甘油菌摇菌~~提取质粒浓度低的情况还是没有改善
5.抗生素，培养基，均是新鲜配制的，且与他人通用，没有问题
6.质粒提取~~试剂盒提取，同样也是与他人共用的，没有问题
7.我将提取过的低浓度质粒再次转化感受态，挑取单菌落摇菌~~~情况，还是一样

能想过的原因都已经找过了，至今找不到原因。百思不得其解，咨询过周围的人大家也表示不理解这种情况~~~
希望小木虫的虫友们能提供帮助，不胜感激!
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1楼 2016-04-09 21:48:55
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2016-04-10 23:00:19
第一，不知道你送测序的时候是菌液还是质粒呢？第二，你的菌生长很快，是个什么概念，OD能到多少？有没有试过过夜摇菌？第三，你理想中质粒浓度应该是多少，才可以达到你要求呢，100纳克每微升我印象中也不是太低吧，电泳时，也大概和5微升marker最亮的条带差不多吧？可以做个酶切看看质粒条带，最好上图。第四，楼主可以试一试不加抗摇菌，验证正确的克隆注意操作，一般不会污染杂菌。最后，实验中其实最怕纠缠纠结，也有和楼主一样的经历，特别是做很多工作来验证自己这个实验过程是错误的，追根刨底的想知道为什么，但其实是我们太自信的把很多可能性给否定了，对于楼主这样情况，建议还是抓紧找其他方法测序验证克隆最重要，送菌液不行那就送质粒，质粒浓度低就延长培养时间或者加大菌液量，质粒还不行就用特异引物直接把目的基因扩增下来，送pcr产物测序……对于质粒浓度问题，我觉得只要不影响实验结果，就继续进行下去，祝好！

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
4楼2016-04-10 11:10:26
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科研虫洞人

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

根据你说的问题，我觉得很有可能是你用的培养基抗性不足，导致最后挑的克隆是杂菌。
菌落PCR鉴定很容易有假阳性。一般氨苄的终浓度要100ug/ml，卡那霉素要50ug/ml，配置时需要培养基的温度不烫手时再加入抗生素，而且含抗生素的培养基培养板不能放置超过一个月。

建议你在菌PCR阳性的基础上加做酶切鉴定，如果酶切鉴定都正确，一般不会测序测不出来。
估计你提的质粒做酶切不一定是阳性。

我总是跟学生说，培养基要自己配，抗生素要用自己的，不要相信别人的东西。我们实验室的学生最近总是有这样类似的问题。希望对你有所帮助。
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20楼2016-04-13 15:34:19
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普通回帖

匿名

用户注销 (正式写手)
本帖仅楼主可见
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2楼2016-04-09 23:15:07
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Anu0103

新虫 (初入文坛)
你摇菌的话，转速是多少呢？浑浊不一定代表菌长得多啊

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3楼2016-04-10 00:04:44
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璇玑lexi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Anu0103 at 2016-04-10 00:04:44
你摇菌的话，转速是多少呢？浑浊不一定代表菌长得多啊

130rpm
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5楼2016-04-10 21:11:43
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璇玑lexi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-04-10 11:10:26
第一，不知道你送测序的时候是菌液还是质粒呢？第二，你的菌生长很快，是个什么概念，OD能到多少？有没有试过过夜摇菌？第三，你理想中质粒浓度应该是多少，才可以达到你要求呢，100纳克每微升我印象中也不是太低吧 ...

送测序菌液和质粒都尝试过，结果都是无信号。曾经送样26个只测出来2个（不同载体的多个样品）。曾经尝试过过夜摇菌，OD2.1，曾经提取质粒浓度至少达到七八百纳克每微，后来方法药品没变，某天突然就变成现在这种情况了。延长培养时间加大菌量等都尝试过～你说的送PCR产物测序我不明白是什么意思？因为即使PCR产物里也会混杂完整或不完整的扩增片段，这样如何保证我后期载体构建时是正确的扩增片段与载体连接呢？
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6楼2016-04-10 21:19:33
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Lyric大元

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-04-10 11:10:26
第一，不知道你送测序的时候是菌液还是质粒呢？第二，你的菌生长很快，是个什么概念，OD能到多少？有没有试过过夜摇菌？第三，你理想中质粒浓度应该是多少，才可以达到你要求呢，100纳克每微升我印象中也不是太低吧 ...

大神说得好啊，我也经常找了很多原因为什么实验失败，但是非常影响情绪，向大神学习。
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热爱生命，珍惜当下。
7楼2016-04-11 21:44:06
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王冠傑

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
6楼: Originally posted by 璇玑lexi at 2016-04-10 21:19:33
送测序菌液和质粒都尝试过，结果都是无信号。曾经送样26个只测出来2个（不同载体的多个样品）。曾经尝试过过夜摇菌，OD2.1，曾经提取质粒浓度至少达到七八百纳克每微，后来方法药品没变，某天突然就变成现在这种情 ...

菌留一部分流行，把另一部分做菌p后测序。如果测序结果没问题说明你的菌可以进行下一步实验，有问题的话再分析喽

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8楼2016-04-11 22:56:55
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表弟爱网游

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-04-13 09:44:18
6个小时确实短了点，你用的什么培养基？长得太快，质粒确实会少一点，但是100ng已经浓度已经不低了，测序足够了。普通LB培养基培养12个小时，大肠杆菌摇菌够提质粒。你可以送一份空载测序，看看是不是测序公司的问题。
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当一切如飞舞的落叶坠落，惋惜之余，也要学会原谅与释怀
9楼2016-04-12 09:13:04
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九根手指

铜虫 (初入文坛)
建议更换测序引物

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中国农业科学院作科所
10楼2016-04-12 11:32:34
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