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大肠杆菌生长速度快质粒浓度低，怎么破？ 已有7人参与
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试验出现问题： 多次摇菌，送去测序均显示模板浓度低，无信号。提取质粒后发现浓度很低（100ng/ul左右），而菌液生长速度很快（早8点摇菌，下午2点菌液已浑浊） 1.已经过菌液PCR及质粒PCR均获得目的条带（PCR过程中设置了对照，排除PCR过程中存在问题） 2.开始怀疑是载体的问题，但更换过克隆载体，高拷贝的空载体，不同抗性的载体等，情况依旧没有得到改善（排除载体存在问题） 3.又怀疑是感受态的问题，于是更换了感受态，情况依旧没有改善(且实验室采用的是商业感受态，其他人也用同样的感受态，没有问题） 4.再怀疑是菌活性的问题，但挑取过新鲜的单克隆菌落，也曾使用过测序正确的甘油菌摇菌~~提取质粒浓度低的情况还是没有改善 5.抗生素，培养基，均是新鲜配制的，且与他人通用，没有问题 6.质粒提取~~试剂盒提取，同样也是与他人共用的，没有问题 7.我将提取过的低浓度质粒再次转化感受态，挑取单菌落摇菌~~~情况，还是一样  能想过的原因都已经找过了，至今找不到原因。百思不得其解，咨询过周围的人大家也表示不理解这种情况~~~ 希望小木虫的虫友们能提供帮助，不胜感激! |
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原海亮
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2016-04-10 23:00:19
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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2016-04-10 23:00:19
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第一，不知道你送测序的时候是菌液还是质粒呢？第二，你的菌生长很快，是个什么概念，OD能到多少？有没有试过过夜摇菌？第三，你理想中质粒浓度应该是多少，才可以达到你要求呢，100纳克每微升我印象中也不是太低吧，电泳时，也大概和5微升marker最亮的条带差不多吧？可以做个酶切看看质粒条带，最好上图。第四，楼主可以试一试不加抗摇菌，验证正确的克隆注意操作，一般不会污染杂菌。最后，实验中其实最怕纠缠纠结，也有和楼主一样的经历，特别是做很多工作来验证自己这个实验过程是错误的，追根刨底的想知道为什么，但其实是我们太自信的把很多可能性给否定了，对于楼主这样情况，建议还是抓紧找其他方法测序验证克隆最重要，送菌液不行那就送质粒，质粒浓度低就延长培养时间或者加大菌液量，质粒还不行就用特异引物直接把目的基因扩增下来，送pcr产物测序……对于质粒浓度问题，我觉得只要不影响实验结果，就继续进行下去，祝好！ 发自小木虫Android客户端 |
4楼2016-04-10 11:10:26
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