应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 大肠杆菌生长速度快质粒浓度低，怎么破？
261/3返回列表123下一页
查看: 5623  |  回复: 25
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

璇玑lexi

新虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌生长速度快质粒浓度低，怎么破？ 已有7人参与

试验出现问题：
多次摇菌，送去测序均显示模板浓度低，无信号。提取质粒后发现浓度很低（100ng/ul左右），而菌液生长速度很快（早8点摇菌，下午2点菌液已浑浊）
1.已经过菌液PCR及质粒PCR均获得目的条带（PCR过程中设置了对照，排除PCR过程中存在问题）
2.开始怀疑是载体的问题，但更换过克隆载体，高拷贝的空载体，不同抗性的载体等，情况依旧没有得到改善（排除载体存在问题）
3.又怀疑是感受态的问题，于是更换了感受态，情况依旧没有改善(且实验室采用的是商业感受态，其他人也用同样的感受态，没有问题）
4.再怀疑是菌活性的问题，但挑取过新鲜的单克隆菌落，也曾使用过测序正确的甘油菌摇菌~~提取质粒浓度低的情况还是没有改善
5.抗生素，培养基，均是新鲜配制的，且与他人通用，没有问题
6.质粒提取~~试剂盒提取，同样也是与他人共用的，没有问题
7.我将提取过的低浓度质粒再次转化感受态，挑取单菌落摇菌~~~情况，还是一样

能想过的原因都已经找过了，至今找不到原因。百思不得其解，咨询过周围的人大家也表示不理解这种情况~~~
希望小木虫的虫友们能提供帮助，不胜感激!
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

科研

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2016-04-09 21:48:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2016-04-10 23:00:19
第一，不知道你送测序的时候是菌液还是质粒呢？第二，你的菌生长很快，是个什么概念，OD能到多少？有没有试过过夜摇菌？第三，你理想中质粒浓度应该是多少，才可以达到你要求呢，100纳克每微升我印象中也不是太低吧，电泳时，也大概和5微升marker最亮的条带差不多吧？可以做个酶切看看质粒条带，最好上图。第四，楼主可以试一试不加抗摇菌，验证正确的克隆注意操作，一般不会污染杂菌。最后，实验中其实最怕纠缠纠结，也有和楼主一样的经历，特别是做很多工作来验证自己这个实验过程是错误的，追根刨底的想知道为什么，但其实是我们太自信的把很多可能性给否定了，对于楼主这样情况，建议还是抓紧找其他方法测序验证克隆最重要，送菌液不行那就送质粒，质粒浓度低就延长培养时间或者加大菌液量，质粒还不行就用特异引物直接把目的基因扩增下来，送pcr产物测序……对于质粒浓度问题，我觉得只要不影响实验结果，就继续进行下去，祝好！

发自小木虫Android客户端
赞一下(3人) 回复此楼
天空才是极限，我有信心飞的更高！
4楼2016-04-10 11:10:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

科研虫洞人

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

根据你说的问题，我觉得很有可能是你用的培养基抗性不足，导致最后挑的克隆是杂菌。
菌落PCR鉴定很容易有假阳性。一般氨苄的终浓度要100ug/ml，卡那霉素要50ug/ml，配置时需要培养基的温度不烫手时再加入抗生素，而且含抗生素的培养基培养板不能放置超过一个月。

建议你在菌PCR阳性的基础上加做酶切鉴定，如果酶切鉴定都正确，一般不会测序测不出来。
估计你提的质粒做酶切不一定是阳性。

我总是跟学生说，培养基要自己配，抗生素要用自己的，不要相信别人的东西。我们实验室的学生最近总是有这样类似的问题。希望对你有所帮助。
赞一下(1人) 回复此楼
20楼2016-04-13 15:34:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

匿名

用户注销 (正式写手)
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2016-04-09 23:15:07
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

Anu0103

新虫 (初入文坛)
你摇菌的话，转速是多少呢？浑浊不一定代表菌长得多啊

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-04-10 00:04:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

璇玑lexi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Anu0103 at 2016-04-10 00:04:44
你摇菌的话，转速是多少呢？浑浊不一定代表菌长得多啊

130rpm
回复此楼
5楼2016-04-10 21:11:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

璇玑lexi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-04-10 11:10:26
第一，不知道你送测序的时候是菌液还是质粒呢？第二，你的菌生长很快，是个什么概念，OD能到多少？有没有试过过夜摇菌？第三，你理想中质粒浓度应该是多少，才可以达到你要求呢，100纳克每微升我印象中也不是太低吧 ...

送测序菌液和质粒都尝试过，结果都是无信号。曾经送样26个只测出来2个（不同载体的多个样品）。曾经尝试过过夜摇菌，OD2.1，曾经提取质粒浓度至少达到七八百纳克每微，后来方法药品没变，某天突然就变成现在这种情况了。延长培养时间加大菌量等都尝试过～你说的送PCR产物测序我不明白是什么意思？因为即使PCR产物里也会混杂完整或不完整的扩增片段，这样如何保证我后期载体构建时是正确的扩增片段与载体连接呢？
赞一下 回复此楼
6楼2016-04-10 21:19:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Lyric大元

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-04-10 11:10:26
第一，不知道你送测序的时候是菌液还是质粒呢？第二，你的菌生长很快，是个什么概念，OD能到多少？有没有试过过夜摇菌？第三，你理想中质粒浓度应该是多少，才可以达到你要求呢，100纳克每微升我印象中也不是太低吧 ...

大神说得好啊，我也经常找了很多原因为什么实验失败，但是非常影响情绪，向大神学习。
赞一下 回复此楼
热爱生命，珍惜当下。
7楼2016-04-11 21:44:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王冠傑

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
6楼: Originally posted by 璇玑lexi at 2016-04-10 21:19:33
送测序菌液和质粒都尝试过，结果都是无信号。曾经送样26个只测出来2个（不同载体的多个样品）。曾经尝试过过夜摇菌，OD2.1，曾经提取质粒浓度至少达到七八百纳克每微，后来方法药品没变，某天突然就变成现在这种情 ...

菌留一部分流行，把另一部分做菌p后测序。如果测序结果没问题说明你的菌可以进行下一步实验，有问题的话再分析喽

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
8楼2016-04-11 22:56:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

表弟爱网游

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-04-13 09:44:18
6个小时确实短了点，你用的什么培养基？长得太快，质粒确实会少一点，但是100ng已经浓度已经不低了，测序足够了。普通LB培养基培养12个小时，大肠杆菌摇菌够提质粒。你可以送一份空载测序，看看是不是测序公司的问题。
赞一下 回复此楼
当一切如飞舞的落叶坠落，惋惜之余，也要学会原谅与释怀
9楼2016-04-12 09:13:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

九根手指

铜虫 (初入文坛)
建议更换测序引物

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
中国农业科学院作科所
10楼2016-04-12 11:32:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 璇玑lexi 的主题更新
261/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 326求调剂 +3 上岸的小葡 2026-03-15 4/200 2026-03-15 18:50 by 无际的草原
[基金申请] NSFC申报书里申请人简历中代表性论著还需要在申报书最后的附件里面再上传一遍吗 20+5 NSFC2026我来了 2026-03-10 13/650 2026-03-15 12:20 by NSFC2026我来了
[考研] 267一志愿南京工业大学0817化工求调剂 +5 SUICHILD 2026-03-12 5/250 2026-03-14 14:53 by jean5056
[考研] 材料080500调剂求收留 +3 一颗meteor 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:54 by peike
[考研] 求调剂，药学 +3 归零lbm 2026-03-09 5/250 2026-03-14 02:21 by JourneyLucky
[考研] 332分材料工程调剂 +3 莓好时光海苔 2026-03-09 3/150 2026-03-14 02:03 by JourneyLucky
[考研] 0703求调剂 +7 jtyq001 2026-03-10 7/350 2026-03-14 01:06 by JourneyLucky
[考研] 一志愿华中农业大学071010，总分三百二,求调剂 +3 困困困困坤坤 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:35 by JourneyLucky
[考研] 招收0805（材料）调剂 +3 18595523086 2026-03-13 3/150 2026-03-14 00:33 by 123%、
[考研] 一志愿湖师大化学289求调剂 +6 XMCMM3.14159 2026-03-10 6/300 2026-03-14 00:28 by JourneyLucky
[考研] 复试调剂 +9 Copy267 2026-03-10 9/450 2026-03-13 23:45 by userper
[考研] 311求调剂 +3 冬十三 2026-03-13 3/150 2026-03-13 20:41 by JourneyLucky
[考研] 【0856】化学工程（085602）313 分，本科学科评估A类院校化学工程与工艺，诚求调剂 +7 小刘快快上岸 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:06 by ruiyingmiao
[考研] 一志愿山大07化学 332分 四六级已过 本科山东双非 求调剂！ +3 不想理你 2026-03-12 3/150 2026-03-13 14:18 by JourneyLucky
[考研] 270求调剂 085600材料与化工专硕 +3 YXCT 2026-03-11 3/150 2026-03-13 10:13 by houyaoxu
[考博] 2026年博士申请 +3 QwQwQW10 2026-03-11 3/150 2026-03-12 17:58 by gxch43
[考研] 085600 材料与化工 295 求调剂 +10 dream…… 2026-03-10 12/600 2026-03-12 13:46 by dream……
[考博] 读博申请 +5 感dd 2026-03-10 7/350 2026-03-11 17:02 by QGZDSYS
[考博] 26申博求助 +3 跳跃饼干 2026-03-10 4/200 2026-03-10 21:15 by Tntcnn
[考研] 收调剂 +7 调剂的考研学生 2026-03-10 7/350 2026-03-10 17:57 by 麦茶汤圆
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭