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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 大肠杆菌生长速度快质粒浓度低，怎么破？
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璇玑lexi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 表弟爱网游 at 2016-04-12 09:13:04
6个小时确实短了点，你用的什么培养基？长得太快，质粒确实会少一点，但是100ng已经浓度已经不低了，测序足够了。普通LB培养基培养12个小时，大肠杆菌摇菌够提质粒。你可以送一份空载测序，看看是不是测序公司的问题 ...

LB培养基，配方就是通用的那个～一般我都是过夜培养但测序菌液和测序质粒依旧是无信号。测序公司换过了，也送过几批次了结果都是这样
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11楼2016-04-12 21:00:16
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璇玑lexi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 九根手指 at 2016-04-12 11:32:34
建议更换测序引物

测序引物都是通用引物。并且测序样品包含多个不同载体，应用不同的测序通用引物。如果测序引物有问题不会所有样品都出现这种情况
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12楼2016-04-12 21:01:29
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璇玑lexi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 王冠傑 at 2016-04-11 22:56:55
菌留一部分流行，把另一部分做菌p后测序。如果测序结果没问题说明你的菌可以进行下一步实验，有问题的话再分析喽
...

现在就是测序有问题测不出来，无信号～菌P和质粒P都正常
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13楼2016-04-12 21:03:33
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qing_eve

金虫 (正式写手)
重新转化

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14楼2016-04-12 23:25:15
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duanjifu520

铜虫 (正式写手)
100ng/微升 浓度很不错了 普通测序足矣 我每次五六十 测序一点问题都没有，要是实在是要求高浓度，你可以用更少体积的洗脱液，或者提质粒时合并几管的量

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15楼2016-04-13 00:47:37
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王冠傑

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 璇玑lexi at 2016-04-12 21:03:33
现在就是测序有问题测不出来，无信号～菌P和质粒P都正常...

我的意思是做完菌落pcr之后将pcr产物直接送去测序，不要纠结，有结果就行，测序只是验证手段

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16楼2016-04-13 07:06:07
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表弟爱网游

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 璇玑lexi at 2016-04-12 21:00:16
LB培养基，配方就是通用的那个～一般我都是过夜培养但测序菌液和测序质粒依旧是无信号。测序公司换过了，也送过几批次了结果都是这样...

空载测序有信号吗
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当一切如飞舞的落叶坠落，惋惜之余，也要学会原谅与释怀
17楼2016-04-13 08:21:11
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ciwei98

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
18楼2016-04-13 09:06:21
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Anu0103

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 璇玑lexi at 2016-04-10 21:11:43
130rpm...

我们实验室用来提质粒的转速都是200rpm

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19楼2016-04-13 10:07:43
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科研虫洞人

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

根据你说的问题，我觉得很有可能是你用的培养基抗性不足，导致最后挑的克隆是杂菌。
菌落PCR鉴定很容易有假阳性。一般氨苄的终浓度要100ug/ml，卡那霉素要50ug/ml，配置时需要培养基的温度不烫手时再加入抗生素，而且含抗生素的培养基培养板不能放置超过一个月。

建议你在菌PCR阳性的基础上加做酶切鉴定，如果酶切鉴定都正确，一般不会测序测不出来。
估计你提的质粒做酶切不一定是阳性。

我总是跟学生说，培养基要自己配，抗生素要用自己的，不要相信别人的东西。我们实验室的学生最近总是有这样类似的问题。希望对你有所帮助。
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20楼2016-04-13 15:34:19
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