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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 用pDM4基因敲入，双交换筛不到突变体
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红笺小字

木虫 (小有名气)

[求助] 用pDM4基因敲入，双交换筛不到突变体

宿主菌为假结核耶尔森氏菌，之前用pDM4做过两次基因敲除或敲入，双交换后筛20个左右，有4到5个为突变体。这一次同时做3个，就是在基因组上的目的基因C端融合表达荧光蛋白，单交换都很顺利得到，但是15%蔗糖平板划线后，筛的单菌落都是野生型，每个筛了50个左右。上下游同源臂500到600bp，得不到突变体的原因是什么？请有经验的虫友指点一二，谢谢。
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且行且珍惜。
1楼 2016-04-05 20:20:14
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
你的菌对蔗果聚糖毒性不敏感？

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2楼2016-04-05 20:47:53
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红笺小字

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2016-04-05 20:47:53
你的菌对蔗果聚糖毒性不敏感？

谢谢您的回复。假结核耶尔森氏菌为肠杆菌科耶尔森氏菌属，革兰氏阴性菌，对蔗果聚糖是敏感的。蔗糖平板划线后除少数sacB基因发生突变外，单菌落都丢失了氯霉素抗性。
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且行且珍惜。
3楼2016-04-05 21:51:25
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
转化的单菌落不纯？

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4楼2016-04-05 21:58:09
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红笺小字

木虫 (小有名气)
三个突变体都已经筛到了，其中一个筛了320个单菌落才筛到。
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且行且珍惜。
5楼2016-04-13 19:02:45
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虫师、

新虫 (初入文坛)
是用15%蔗糖筛选的吗？单交换的结果用不加抗性的液体摇的吗？

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6楼2017-08-15 15:20:17
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红笺小字

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 虫师、 at 2017-08-15 15:20:17
是用15%蔗糖筛选的吗？单交换的结果用不加抗性的液体摇的吗？

嗯，15%蔗糖，单交换菌有含氯霉素培养基摇。
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且行且珍惜。
7楼2017-08-15 22:12:13
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