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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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zmlizm

铁虫 (小有名气)

[求助] 连接T载体成功后发现连的不是目的基因 已有2人参与

首先，我们的基因是从基因组文库中拿到的。
第一步做PCR扩增，
采用的是25ul的反应体系，引物为xho1和Bamh1，各取0.5ul,模版0.25ul，2*taq22.5ul，dd水11.25ul
过程是30个循环，95度3min,95度30s,53度30s,72度2min,,72度10min,4度keep
跑胶后结果有一些杂带，其中有一条是小于500bp,我们的目的基因是1800多bp,
第二步是琼脂糖凝胶回收了1800bp的那条带，
第三步是连接T载体过夜，（T载体是takara的pmd 18-t vector cloing kit）
第四步是转化到感受态细胞内然后涂板（氨苄）
然后长出来了点，我挑了五个点，然后用PCR产物做正对照，目的基因的两条引物，发现跑出的条带均为不足500bp的，
接着我还是再用那五个点，用t载体的引物，发现跑出的仍然为500bp

连接T载体成功后发现连的不是目的基因
Des_splash.png
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1楼 2016-03-29 21:25:10
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)
假阳性呗

发自小木虫IOS客户端
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2楼2016-03-29 23:01:04
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)
正常的

发自小木虫IOS客户端
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3楼2016-03-29 23:01:31
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daid01

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zmlizm: 金币+1, ★有帮助 2016-04-02 15:36:56
这个平时做也是有可能的 这个的话一般就是酶切的位点有问题了
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4楼2016-03-31 10:20:53
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zmlizm

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by daid01 at 2016-03-31 10:20:53
这个平时做也是有可能的 这个的话一般就是酶切的位点有问题了

可是我还没有酶切呢，这个问题怎么解决呢，已经做过很多次，每次转化出来的都是连了500bp的，这条是怎么来的呢，已经跑了回收产物，也是只有1800的，那个500的是怎么连上的呢？
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5楼2016-03-31 11:29:28
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chinaaoju

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zmlizm: 金币+1 2016-04-02 15:34:25
不管怎样先把那个条带测个序，才能再分析！
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6楼2016-04-01 17:00:31
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zmlizm

铁虫 (小有名气)
那个500的引物是什么都不知道也可以测序吗？

发自小木虫Android客户端
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7楼2016-04-02 15:36:25
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