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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 候选基因扩增，求助！！
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空地上的飞鹰

新虫 (小有名气)

[求助] 候选基因扩增，求助！！ 已有1人参与

各位虫友，大家好，我做的是大豆突变体定位。最近，一直在做候选基因的筛选。主要是测序。但最近利用突变体的RNA进行转录组测序，其琼脂糖凝胶的条带总是看不见，二次PCR时也没有多少条带。而且有条带的其条带大小却和我的基因大小相差很多。另外测序回来的样品好多有双峰，应该怎样避免双峰。恳请大家给点建议。
1.括基因应该注意啥?
2.琼脂糖凝胶120v，400mA这样设计可以不？
3.双峰怎么避免？谢谢

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1楼 2016-03-25 14:43:51
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tbsjxy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
第一，首先你要确保你RNA提取没有问题，你检测都看不见条带，确定可以做下去？建议用试剂盒提。
第二，扩增条带和目的基因差很多的话，先确定一下你设计的引物特异性好不好，如果没有问题的话，差别大的话也是有可能，考虑是插入突变或融合基因的可能。
第三，测序双峰，最直接的解决方法是构建载体去测序，当然也可以考虑先切胶回收试试，具体要看看胶图怎么样，建议问下测序公司客服的意见。
根据楼主的叙述，问题出在第一步的可能性较大。
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该用户由于违规已被禁言一辈子
2楼2016-03-25 15:21:15
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空地上的飞鹰

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tbsjxy at 2016-03-25 15:21:15
第一，首先你要确保你RNA提取没有问题，你检测都看不见条带，确定可以做下去？建议用试剂盒提。
第二，扩增条带和目的基因差很多的话，先确定一下你设计的引物特异性好不好，如果没有问题的话，差别大的话也是有可 ...

谢谢，我感觉也是，我测了一下Rna的浓度才50多，不知道多少比较合适？我就用的试剂盒提的。

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3楼2016-03-25 19:29:34
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