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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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經天

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 提取质粒遇到的问题,希望高级虫虫赐教!

最近提取一株未知菌株的质粒DNA,可总是提不出来,电泳检测结果显示前面有一条弥散的条带,点样孔中还有DNA样品,请问怎样做能改善试验啊?
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恒星年

银虫 (正式写手)

前面弥散的是不是RNA啊?跑不出来有可能是蛋白质没除干净,如果蛋白存余较多会影响电泳。
2楼2008-10-21 21:17:51
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zhongdianshi

银虫 (小有名气)

此菌是否在已知的抗性平板上生长正常?
提取质粒的试剂是否正常工作?
提取出来的质粒是否可以转化感受态,在已知的抗性平板上生长?
弥散的条带有可能是RNA,“点样孔的DNA”可能是拿到的DNA不纯,杂蛋白太多,或者基因组DNA,滞留在加样孔。

假设你手头的菌没有问题,在正确的抗性LB中,过夜培养。
你的提取质粒试剂没有问题。
提取的过程没问题。
你的胶没问题。
你的电泳缓冲液用新鲜的。
。。。
引用回帖:
Originally posted by 經天 at 2008-10-20 00:01:
最近提取一株未知菌株的质粒DNA,可总是提不出来,电泳检测结果显示前面有一条弥散的条带,点样孔中还有DNA样品,请问怎样做能改善试验啊?

3楼2008-10-22 07:07:15
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j2

木虫 (正式写手)

试剂盒提的?不应该蛋白杂志这么多啊。确定试剂没问题?
修炼ing,当虫仙……
4楼2008-10-22 09:06:02
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helenfang

铜虫 (小有名气)

恩建议用试剂盒提,会好很多,我们的菌就是很难提质粒DNA,不用试剂盒提的时候多糖物质和蛋白很难除去,但是倒没有你说的那么夸张。
5楼2008-10-22 15:29:57
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amberking

点样孔应该是没去除的杂蛋白,1%左右浓度的胶溴酚蓝前面是RNA

杂质没去除一般倒也问题不大,你把溶液3的Ph值测一下,如果高质粒是提不出来的
恩,或者溶液2的SDS时间久了,重配吧

要去除杂质,酚/氯仿多抽提几次,加点DNaseI好了
恩,还有重拿一管抗生素用
6楼2008-10-23 14:28:57
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經天

铁杆木虫 (著名写手)

谢谢各位的指教!
前面的条带比较宽,有在溴酚蓝前面,也有在后面的,可能是RNA,试剂应该没有问题吧,后来我全部重新配了,结果还是一样,不过摇菌的时间比较长,16h,因为是这株菌的质粒没有提过,文献上说大约有5种质粒,可我一个也没有提到,郁闷!
再提几次,多进行蛋白质的去除,再加RNase,一定要提出来!

[ Last edited by 經天 on 2008-10-24 at 10:14 ]
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7楼2008-10-24 10:13:18
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)

可能你的菌就没有质粒啊,或者很大一般的方法提不出来的
帮助虫友,提升自己
8楼2008-10-24 21:03:33
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platanus

木虫 (著名写手)

你前面弥散的带应该是RNA,你说摇了16个小时,应该是没有问题的,一般俄抗生素在16个小时之内是还不会失效的!
9楼2008-10-27 22:09:09
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hiking8715

金虫 (小有名气)

不是有RNA消化酶吗,加上后,半个小时后就可以了
10楼2008-10-28 20:52:14
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