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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 提取质粒遇到的问题，希望高级虫虫赐教！
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經天

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 提取质粒遇到的问题，希望高级虫虫赐教！

最近提取一株未知菌株的质粒DNA，可总是提不出来，电泳检测结果显示前面有一条弥散的条带，点样孔中还有DNA样品，请问怎样做能改善试验啊？
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1楼 2008-10-20 00:01:57
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恒星年

银虫 (正式写手)
前面弥散的是不是RNA啊？跑不出来有可能是蛋白质没除干净，如果蛋白存余较多会影响电泳。
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2楼2008-10-21 21:17:51
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zhongdianshi

银虫 (小有名气)
此菌是否在已知的抗性平板上生长正常？
提取质粒的试剂是否正常工作？
提取出来的质粒是否可以转化感受态，在已知的抗性平板上生长？
弥散的条带有可能是RNA，“点样孔的DNA”可能是拿到的DNA不纯，杂蛋白太多，或者基因组DNA，滞留在加样孔。

假设你手头的菌没有问题，在正确的抗性LB中，过夜培养。
你的提取质粒试剂没有问题。
提取的过程没问题。
你的胶没问题。
你的电泳缓冲液用新鲜的。
。。。
引用回帖:
Originally posted by 經天 at 2008-10-20 00:01:
最近提取一株未知菌株的质粒DNA，可总是提不出来，电泳检测结果显示前面有一条弥散的条带，点样孔中还有DNA样品，请问怎样做能改善试验啊？

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3楼2008-10-22 07:07:15
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j2

木虫 (正式写手)
试剂盒提的？不应该蛋白杂志这么多啊。确定试剂没问题？
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
4楼2008-10-22 09:06:02
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helenfang

铜虫 (小有名气)
恩建议用试剂盒提，会好很多，我们的菌就是很难提质粒DNA，不用试剂盒提的时候多糖物质和蛋白很难除去，但是倒没有你说的那么夸张。
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5楼2008-10-22 15:29:57
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amberking

点样孔应该是没去除的杂蛋白，1%左右浓度的胶溴酚蓝前面是RNA

杂质没去除一般倒也问题不大，你把溶液3的Ph值测一下，如果高质粒是提不出来的
恩，或者溶液2的SDS时间久了，重配吧

要去除杂质，酚/氯仿多抽提几次，加点DNaseI好了
恩，还有重拿一管抗生素用
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6楼2008-10-23 14:28:57
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經天

铁杆木虫 (著名写手)
谢谢各位的指教！
前面的条带比较宽，有在溴酚蓝前面，也有在后面的，可能是RNA，试剂应该没有问题吧，后来我全部重新配了，结果还是一样，不过摇菌的时间比较长，16h，因为是这株菌的质粒没有提过，文献上说大约有5种质粒，可我一个也没有提到，郁闷！
再提几次，多进行蛋白质的去除，再加RNase，一定要提出来！

[ Last edited by 經天 on 2008-10-24 at 10:14 ]
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7楼2008-10-24 10:13:18
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
可能你的菌就没有质粒啊，或者很大一般的方法提不出来的
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帮助虫友，提升自己
8楼2008-10-24 21:03:33
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platanus

木虫 (著名写手)
你前面弥散的带应该是ＲＮＡ，你说摇了１６个小时，应该是没有问题的，一般俄抗生素在１６个小时之内是还不会失效的！
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9楼2008-10-27 22:09:09
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hiking8715

金虫 (小有名气)
不是有RNA消化酶吗，加上后，半个小时后就可以了
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10楼2008-10-28 20:52:14
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