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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 菜鸟求助，大神莫要耻笑。。。
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小李纸11

银虫 (正式写手)

[求助] 菜鸟求助，大神莫要耻笑。。。 已有2人参与

现在已经有质粒转化好的大肠杆菌感受态细胞，已经进行完蓝白筛选了，接下来该怎么诱导表达呢(用IPTG诱导），求详细的操作步骤，最详细的那种（比如各试剂加的量等等）。。。谢谢啦!
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1楼 2016-03-01 10:07:17
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叶堪默

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提质粒转到农杆菌里吧，我就是这么做的。
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2楼2016-03-01 10:45:16
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.蓝白斑筛选的转化子，要经过酶切验证确认为正确的克隆，必要的时候进行测序。2.拿到正确的克隆后（通常已经保存为甘油管），晚上转接至5ml的LB液体培养基，过夜37°培养。3.早上取出过夜培养物（可以暂时放置4°，待中午左右转接），按百分之一的比例转接至50ml的LB摇瓶（250ml瓶），37°摇床继续培养至OD0.6-0.8左右。4.取出来加IPTG诱导，诱导终浓度我们通常选择0.4mM，第一次做可以进行剃度诱导（就是多转接几个摇瓶，分别加不同浓度iptg），5.将添加诱导剂后的摇瓶放至摇床诱导，诱导温度一般可以选择几个常用，20°，25°，30°，37°都可以尝试，160rpm过夜诱导。6.过夜后，将菌液离心去上清，菌体用低浓度PBS重悬后（一般浓缩十倍），进行超声破碎。7.破碎后离心，将上清沉淀分离后，分别进行SDS_PAGE检测，检测目的蛋白。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
3楼2016-03-01 12:32:58
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小李纸11

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-01 12:32:58
1.蓝白斑筛选的转化子，要经过酶切验证确认为正确的克隆，必要的时候进行测序。2.拿到正确的克隆后（通常已经保存为甘油管），晚上转接至5ml的LB液体培养基，过夜37°培养。3.早上取出过夜培养物（可以暂时放置4°， ...

太感谢啦~
还想请问一下，测序是做PCR扩增吗？导师说让做个菌液PCR验证一下提出来的质粒是不是目的基因，，，
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4楼2016-03-01 16:40:57
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小李纸11

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 叶堪默 at 2016-03-01 10:45:16
提质粒转到农杆菌里吧，我就是这么做的。

转化到大肠杆菌里面。。。
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5楼2016-03-01 16:42:11
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小李纸11: 金币+10 2016-03-01 19:39:26
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小李纸11 at 2016-03-01 16:40:57
太感谢啦~
还想请问一下，测序是做PCR扩增吗？导师说让做个菌液PCR验证一下提出来的质粒是不是目的基因，，，...

测序是要交给公司测的，一般实验室很少有能力自己测。老师让你做的菌液PCR，只是定性的看看有没有目的条带的插入，只可以初步判断条带大小，而条带的序列是否正确是需要进行测序分析才可以的。菌液pcr（需要对应载体的通用引物或者目的条带的特异性引物）和双酶切（需要挑取转化子抽提质粒）是比较常用的筛选阳性克隆的方法，你看你们实验室常用的是什么吧，个人觉得最双酶切相对比较可靠些，祝好！

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
6楼2016-03-01 17:45:30
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小李纸11

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-01 17:45:30
测序是要交给公司测的，一般实验室很少有能力自己测。老师让你做的菌液PCR，只是定性的看看有没有目的条带的插入，只可以初步判断条带大小，而条带的序列是否正确是需要进行测序分析才可以的。菌液pcr（需要对应载 ...

以后有不懂的地方还要向前辈请教啊，谢谢~~~
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7楼2016-03-01 19:39:16
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