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求酵母菌 ITS区 PCR 引物及反应条件 已有1人参与
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求！ 真菌（主要是酵母及酵母样真菌）pcr扩增 ITS区 条件和引物序列 和 PCR条件？ 用于测序鉴定用的我用的ITS1 和 ITS4引物 ，文献中查到的序列 各一条 没有上下游区分；预变性94度 3min，变性94度30s和1min都试过，退火时间30s和1min都试过，梯度退火50度-60度 都没扩增出来；换了别人的taq酶没扩增出来，也换了PCR仪 都没有扩增出来，电泳一片空白 请教各位，我哪里出现问题了呀？ 各位谁做过真菌 ITS？可以告诉我你们的引物序列吗？还有反应条件 谢谢啦！ |
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【答案】应助回帖
| 我用的是分子克隆上的快速提取法提酵母基因组，没什么问题。大于2.1对于PCR扩增影响不大！变性时间一般30S就够了，退火温度楼主看一下两个引物的Tm值，再上下加减5度做一个梯度PCR就可以找到最适退火温度了。延伸时间看的是你产物长度，一般1~2kb/min。最好调整一下模板至终浓度20ng/μl，用的时候加1~2μl足够了，一般模板浓度不是特别高的话影响不大的。电泳的时候Marker有条带吗？如果有就不是电泳的问题了。Loading buffer降解也会使电泳条带看不到或弥散。一个一个问题进行排除吧。 |
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