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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 免疫实验 » 小鼠脾细胞Th流式CD4染色极少怎么破…
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ErtLee

金虫 (小有名气)

[求助] 小鼠脾细胞Th流式CD4染色极少怎么破… 已有2人参与

感觉做Th流式CD4+一直非常少，求大神讲解，下面是大概的流程…
淋巴细胞分离液处理的Balb/c正常小鼠脾细胞，大概1*10^6／ml，24孔板每孔1ml做刺激: PMA 50ng／ml, Ionomycin 1ug／ml, Golgistop 照BD说明书加的，刺激时间一般6~8h。第二天收了以后胞外染色、固定穿透、胞内染色。固定穿透用的是ebioscience的permeabilization buffer和fixation/ permeabilizaton concentrate，流式抗体都是ebioscience的(CD4,IL4, IFNr)。重复了几次下来都存在CD4+极少甚至染不上(0.5%以下，很多0.1%不到)。

请问这种染色效率是否正常？看到过一种说法是刺激物会引起CD4的表达量减少和内吞，这种情况在实验过程里应该怎么避免？CD3+CD8-作为CD4+的替代标记这种做法在小鼠细胞实验里是否能够得到认可？

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1楼 2016-01-29 16:46:18
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徐州往事

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

PMA刺激4小时以后CD4数量就开始下降，过夜培养数量会降的更低。如果必须过夜培养，可以利用CD3CD8反向射门来分析你所需要的细胞群。

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2楼2016-02-04 00:46:23
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)
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3楼2016-03-03 21:22:55
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)
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4楼2016-03-03 21:25:24
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ErtLee

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ghqiu09 at 2016-03-03 21:22:55
我有个疑问，为什么需要用淋巴细胞分离也去分离？反正流式收的时候收的都是淋巴细胞，脾里面30%左右是T细胞，60%左右是B细胞，其他的细胞比较少。我虽然不做Th细胞，但是Treg那些我从来是直接破碎后过滤染色。

之前用是下游要顺便做ELISPOT，所以就一直都用了…

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5楼2016-04-01 13:58:13
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ErtLee

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ghqiu09 at 2016-03-03 21:25:24
我也用过PMA这些东西，一般都是刺激4个小时后就收了，不过夜。我记得看过一篇帖子，在4小时，JNK信号通路就已经激活了，到了后面并不清楚会不会发生什么变化，虽然和CD4这些应该没啥关系，但是4小时足以。。。

最近发现我这套溶液是做Treg核染的，做胞质染有另外的，或者直接多聚甲醛。每次做都是Th,Treg一起用的这套溶液，也不知道是不是这个原因。

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6楼2016-04-01 14:01:06
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2016-04-01 22:08:52
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ErtLee

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ghqiu09 at 2016-04-01 22:08:52
我们用然核内和胞内的固定破膜液是有区别的，核内的会麻烦一些，需要过夜...

感谢感谢，下次换了试试，不是这个也想不到什么其他原因了～

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8楼2016-04-01 23:34:38
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