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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 有人从genomic DNA里PCR过大于8kb的长片段吗？
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dataideng

银虫 (初入文坛)

[交流] 有人从genomic DNA里PCR过大于8kb的长片段吗？ 已有7人参与

最近需要从genomic DNA里PCR一段8kb的片段，用的kit是Roche  Expand™ Long Template PCR System。引物长度~21bp，退火温度比Tm低2度。其余都是按protocol设置的。但是一直没有P出来。
有人有这种从基因组PCR长片段的经验吗？感谢分享和交流。
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1楼 2016-01-27 10:28:35
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
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8 kb用长片段扩增试剂盒很容易就扩出来了，引物设计长一些，在25-30 bp左右，Tm设置在65℃，用生工的产品编号为 B639285的Long and Accurate PCR Kit，扩增过15 kb，扩增条带挺亮的
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rainwater
4楼2016-01-28 12:19:37
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fjtony163

版主 (文坛精英)

米米

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们一般是做3到4kb 考虑把初始变性时间延长到七分钟以上

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2楼2016-01-28 00:38:46
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sloop112

禁虫 (小有名气)
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3楼2016-01-28 09:44:35
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by zhangyunjing at 2016-01-28 12:19:37
8 kb用长片段扩增试剂盒很容易就扩出来了，引物设计长一些，在25-30 bp左右，Tm设置在65℃，用生工的产品编号为 B639285的Long and Accurate PCR Kit，扩增过15 kb，扩增条带挺亮的

你这扩一次pcr要挺久的吧
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5楼2016-01-28 23:34:44
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们实验室用诺维赞的酶可以在多倍体基因组中扩出8kb左右的片段，扩增速度~4kb/min。你可以试试。而且这个酶也不贵
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
6楼2016-01-29 09:08:13
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by 键盘上的脚丫 at 2016-01-28 23:34:44
你这扩一次pcr要挺久的吧...

一般都是过夜扩增的，扩增片段长度不同，时间设置是不同的
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rainwater
7楼2016-01-29 10:18:34
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dataideng

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fjtony163 at 2016-01-28 00:38:46
我们一般是做3到4kb 考虑把初始变性时间延长到七分钟以上

但是说明书写2分钟，不敢乱改啊

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8楼2016-01-29 22:45:39
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dataideng

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangyunjing at 2016-01-28 12:19:37
8 kb用长片段扩增试剂盒很容易就扩出来了，引物设计长一些，在25-30 bp左右，Tm设置在65℃，用生工的产品编号为 B639285的Long and Accurate PCR Kit，扩增过15 kb，扩增条带挺亮的

你的DNA是从血液里提的？

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9楼2016-01-29 22:46:22
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dataideng

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 游侠892 at 2016-01-29 09:08:13
我们实验室用诺维赞的酶可以在多倍体基因组中扩出8kb左右的片段，扩增速度~4kb/min。你可以试试。而且这个酶也不贵

请问你的基因组是怎么准备的？PCR产物跑胶回收？

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10楼2016-01-29 22:47:25
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