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dataideng

银虫 (初入文坛)

[交流] 有人从genomic DNA里PCR过大于8kb的长片段吗?已有7人参与

最近需要从genomic DNA里PCR一段8kb的片段,用的kit是Roche  Expand™ Long Template PCR System。引物长度~21bp,退火温度比Tm低2度。其余都是按protocol设置的。但是一直没有P出来。
有人有这种从基因组PCR长片段的经验吗?感谢分享和交流。
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)


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8 kb用长片段扩增试剂盒很容易就扩出来了,引物设计长一些,在25-30 bp左右,Tm设置在65℃,用生工的产品编号为 B639285的Long and Accurate PCR Kit,扩增过15 kb,扩增条带挺亮的
rainwater
4楼2016-01-28 12:19:37
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fjtony163

版主 (文坛精英)

米米

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我们一般是做3到4kb 考虑把初始变性时间延长到七分钟以上

发自小木虫IOS客户端
2楼2016-01-28 00:38:46
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sloop112

禁虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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3楼2016-01-28 09:44:35
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)


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4楼: Originally posted by zhangyunjing at 2016-01-28 12:19:37
8 kb用长片段扩增试剂盒很容易就扩出来了,引物设计长一些,在25-30 bp左右,Tm设置在65℃,用生工的产品编号为 B639285的Long and Accurate PCR Kit,扩增过15 kb,扩增条带挺亮的

你这扩一次pcr要挺久的吧
5楼2016-01-28 23:34:44
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)


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我们实验室用诺维赞的酶可以在多倍体基因组中扩出8kb左右的片段,扩增速度~4kb/min。你可以试试。而且这个酶也不贵
路漫漫其修远兮,吾将上下而求索
6楼2016-01-29 09:08:13
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)


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5楼: Originally posted by 键盘上的脚丫 at 2016-01-28 23:34:44
你这扩一次pcr要挺久的吧...

一般都是过夜扩增的,扩增片段长度不同,时间设置是不同的
rainwater
7楼2016-01-29 10:18:34
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dataideng

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by fjtony163 at 2016-01-28 00:38:46
我们一般是做3到4kb 考虑把初始变性时间延长到七分钟以上

但是说明书写2分钟,不敢乱改啊

发自小木虫Android客户端
8楼2016-01-29 22:45:39
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dataideng

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangyunjing at 2016-01-28 12:19:37
8 kb用长片段扩增试剂盒很容易就扩出来了,引物设计长一些,在25-30 bp左右,Tm设置在65℃,用生工的产品编号为 B639285的Long and Accurate PCR Kit,扩增过15 kb,扩增条带挺亮的

你的DNA是从血液里提的?

发自小木虫Android客户端
9楼2016-01-29 22:46:22
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dataideng

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 游侠892 at 2016-01-29 09:08:13
我们实验室用诺维赞的酶可以在多倍体基因组中扩出8kb左右的片段,扩增速度~4kb/min。你可以试试。而且这个酶也不贵

请问你的基因组是怎么准备的?PCR产物跑胶回收?

发自小木虫Android客户端
10楼2016-01-29 22:47:25
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