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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 转化鉴定
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amberhwk

新虫 (小有名气)

[求助] 转化鉴定 已有1人参与

转化后平板长菌，但是摇菌后菌落pcr没有目的条带，会是什么原因，已经挑菌很多次，大家一般是直接5ml液体培养基摇菌还是Ep管摇菌，阳性验证好再扩大呢

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1楼 2016-01-21 10:04:14
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amberhwk

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-21 10:50:40
我一般是使用EP管，里面加200μl抗性培养基，将单克隆挑取到里面。摇浓了之后，取1μl进行菌落PCR检测，正确了则把剩下的菌液加到5ml抗性培养基中进行扩大。

PCR扩增不出来的原因有很多，我一般采用质粒上的外围 ...

刚开始做很多都不太明白，外围引物是什么意思

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3楼2016-01-21 14:36:44
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by amberhwk at 2016-01-21 14:36:44
刚开始做很多都不太明白，外围引物是什么意思
...

就是质粒上的一对引物，通常在多克隆位点的两侧，您的基因插入其中。
以pET系列质粒举例，有外围引物T7-promoter primer和T7 terminator primer。这之间如果不插入基因的话，扩增长度大概在一百多bp左右。
这样的好处是，无论你插入什么基因，都可以用这一对引物进行验证。
并且，这对外围引物通常很容易就能够将其中的序列扩增出来。如果没有条带，说明PCR有问题，而不是其中没有插入基因。
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4楼2016-01-21 15:29:32
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amberhwk

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-21 15:29:32
就是质粒上的一对引物，通常在多克隆位点的两侧，您的基因插入其中。
以pET系列质粒举例，有外围引物T7-promoter primer和T7 terminator primer。这之间如果不插入基因的话，扩增长度大概在一百多bp左右。
这样的 ...

哦明白了，谢谢解答

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5楼2016-01-21 16:37:40
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