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银虫 (小有名气)

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[求助] 荧光定量PCR检测攻毒后各组织的病毒含量需要设置内参吗？已有3人参与

各位虫友：
最近攻毒了一批动物，发病后想检测该动物各组织的病毒含量，现在已经建立了一个定量PCR方法，知道标准曲线，现在的问题是：
1.采取组织样品的时候是否要相同的量？
2.咨询了几个人说要用内参，想问下内参怎么设置以及意义？
3.查询文献没有设置特定的内参，均是用标准曲线计算，疑惑是否需要设置内参？
4.在做此类实验时候有什么要注意的事项吗？

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向阳生长……

1楼 2016-01-20 11:48:16

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足下客

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

内参也叫内标，是为了保证数据之间的可比性。内标的Ct值要控制在Ct31左右，内标浓度如果过高，会严重影响到目的基因的扩增。
内标：已知低含量的与模板扩增效率相似的一段DNA片段，将它加入PCR反应液中，与模板共同扩增，以反应每管真实得扩增情况如果内标和样品都未扩增出结果，则表示该管扩增无效，应重新做。
我们在提取核酸时，有时也会将内标加进去，不仅可以监控反应体系是否有效；也可以监控整个提取过程的有效性，同时实现核酸提取过程和扩增过程的监控。