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siyuansing银虫 (小有名气)
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酶切问题 已有2人参与
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T载体插入了500bp的片段，T载体是takara的pMD19（simple）2692bp，无酶切位点，目的基因两段构建有EcoR I和Xba I两个酶切位点。单酶切没有效果，双酶切表现出了单酶切的效果。如图，从左向右分别是：1000marker，质粒跑胶结果，双酶切效果，EcoR I单酶切，Xba I单酶切；最右是5000的maker。 双酶切体系试过两个，效果都如同图中一样： EcoR I：1μl EcoR I：1μl Xba I：1μl Xba I：1μl x10 M buffer：2μl x10 M buffer：2μl BSA：2μl DNA（300ng/μl）：3μl DNA（300ng/μl）：3μl DEPC水：16μl DEPC水：13μl 酶都是takara的限制性内切酶，酶切条件都是37℃，12h。 EcoR I的酶切体系为： EcoR I：1μl x10 H buffer：2μl DEPC水：17μl Xba I的酶切体系为： Xba I：1μl x10 M buffer：2μl BSA：2μl DEPC水：15μl 单酶切体系都是根据说明书上配的，双酶切体系是根据说明书中双酶切反应使用表配的。 搞不懂为什么单酶切没有效果，双酶切却只表现出了单酶切的效果。另外，质粒总大小应该是3100bp左右，没有切开的质粒会跑出两条带么？而且跑胶结果的大小远大于3100bp。 请大家帮忙解惑，谢谢大家了。  PC 2016-01-16 14 时 21 分副本.jpg |
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siyuansing: 回帖置顶 2016-01-17 12:49:44
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XbaI受dam甲基化影响严重，我记得识别序列为TCTAGA，如果酶切位点前面为GA或者后面为TC，就肯定切不开！ECORI我不太记得了，好好看看！都是常用酶，一般是因为疏忽了这种问题导致的！ 发自小木虫Android客户端 |
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siyuansing4楼2016-01-16 15:38:37
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重新设计一下XbaI那边的引物就好了！没必要去买那种甲基化酶缺失的感受态！ 发自小木虫Android客户端 |
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9楼2016-01-18 10:12:33
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