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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 酶切问题
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siyuansing

银虫 (小有名气)

[求助] 酶切问题 已有2人参与

T载体插入了500bp的片段，T载体是takara的pMD19（simple）2692bp，无酶切位点，目的基因两段构建有EcoR I和Xba I两个酶切位点。单酶切没有效果，双酶切表现出了单酶切的效果。如图，从左向右分别是：1000marker，质粒跑胶结果，双酶切效果，EcoR I单酶切，Xba I单酶切；最右是5000的maker。
双酶切体系试过两个，效果都如同图中一样：
EcoR I：1μl                                  EcoR I：1μl
Xba I：1μl                                    Xba I：1μl
x10 M buffer：2μl                        x10 M buffer：2μl
BSA：2μl                                     DNA（300ng/μl）：3μl
DNA（300ng/μl）：3μl               DEPC水：16μl
DEPC水：13μl

酶都是takara的限制性内切酶，酶切条件都是37℃，12h。
EcoR I的酶切体系为：
EcoR I：1μl
x10 H buffer：2μl
DEPC水：17μl

Xba I的酶切体系为：
Xba I：1μl
x10 M buffer：2μl
BSA：2μl
DEPC水：15μl

单酶切体系都是根据说明书上配的，双酶切体系是根据说明书中双酶切反应使用表配的。
搞不懂为什么单酶切没有效果，双酶切却只表现出了单酶切的效果。另外，质粒总大小应该是3100bp左右，没有切开的质粒会跑出两条带么？而且跑胶结果的大小远大于3100bp。
请大家帮忙解惑，谢谢大家了。

酶切问题
PC 2016-01-16 14 时 21 分副本.jpg
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1楼 2016-01-16 15:12:20
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sonny

金虫 (著名写手)

siyuansing: 回帖置顶 2016-01-17 12:49:44
XbaI受dam甲基化影响严重，我记得识别序列为TCTAGA，如果酶切位点前面为GA或者后面为TC，就肯定切不开！ECORI我不太记得了，好好看看！都是常用酶，一般是因为疏忽了这种问题导致的！

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siyuansing siyuansing
4楼2016-01-16 15:38:37
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sonny

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
6楼: Originally posted by siyuansing at 2016-01-17 12:50:47
显示不是应助回帖，不能评分...

没关系，这些东西去NEB的英文网站都可以查到，用到的时候搜一下就好了，我也没刻意整理过！呵呵！很高兴帮到你！

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8楼2016-01-18 10:07:34
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sonny

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
siyuansing: 金币+30, ★★★★★最佳答案 2016-01-23 09:32:51
引用回帖:
7楼: Originally posted by siyuansing at 2016-01-17 18:03:23
实验重新做了，验证了，酶都是没有问题的，至于单酶切没有切出来可能是实验失误。
重新给pUC19和我的这个质粒分别做单双酶切，pUC19全部切成功，我的质粒单酶切只有Xba I没有切出来，另一个单酶切切开了，双酶切效 ...

重新设计一下XbaI那边的引物就好了！没必要去买那种甲基化酶缺失的感受态！

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siyuansing
9楼2016-01-18 10:12:33
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smallkokoko

新虫 (初入文坛)
虽然我也不懂为什么，但是加油哦！

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2楼2016-01-16 15:22:50
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smallkokoko

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提质粒有两条带是正常的。因为还有些基因组啊或者断掉的DNA

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2016-01-16 15:25:22
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siyuansing

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by sonny at 2016-01-16 15:38:37
XbaI受dam甲基化影响严重，我记得识别序列为TCTAGA，如果酶切位点前面为GA或者后面为TC，就肯定切不开！ECORI我不太记得了，好好看看！都是常用酶，一般是因为疏忽了这种问题导致的！
...

这个金币必须全部给你，果然是甲基化的问题。非常感谢！另外关于什么样的序列容易被甲基化有些资料能分享么？

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5楼2016-01-17 12:48:30
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siyuansing

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by sonny at 2016-01-16 15:38:37
XbaI受dam甲基化影响严重，我记得识别序列为TCTAGA，如果酶切位点前面为GA或者后面为TC，就肯定切不开！ECORI我不太记得了，好好看看！都是常用酶，一般是因为疏忽了这种问题导致的！
...

显示不是应助回帖，不能评分
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6楼2016-01-17 12:50:47
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siyuansing

银虫 (小有名气)
实验重新做了，验证了，酶都是没有问题的，至于单酶切没有切出来可能是实验失误。
重新给pUC19和我的这个质粒分别做单双酶切，pUC19全部切成功，我的质粒单酶切只有Xba I没有切出来，另一个单酶切切开了，双酶切效果和EcoR I切开效果相同，回复的时候无法加载图片，也无法编辑原文。sonny那位朋友讲的很有道理，大家以后设计酶切位点的时候要多注意。谢谢诸位了。
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7楼2016-01-17 18:03:23
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siyuansing

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
9楼: Originally posted by sonny at 2016-01-18 10:12:33
重新设计一下XbaI那边的引物就好了！没必要去买那种甲基化酶缺失的感受态！
...

已经重新做了引物了，谢谢啦

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10楼2016-01-23 09:33:24
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