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当归加首乌

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR的结果没有目的片段，换过很多条件。求大神指导！ 已有14人参与

第一次用高保真酶很顺利扩出来了大部分基因，可是后面用普通酶就扩不出来了

改变的条件就俩：1、高保真酶换成了普通酶；2、cDNA量加大了，从30ng左右加达到了300ng左右。

现在换了很多退火温度，都不行！条带都在marker最下面一条那。求帮助！！

图是今天跑的，左边是引物、cDNA。右边是扩增产物。

图中分别是引物（<100）,cDNA（中间），PCR产物（<100）

PCR的结果没有目的片段，换过很多条件。求大神指导！
1.png
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总是记不起密码~~~
1楼 2016-01-15 11:11:30
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lifechuteng

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换条件治标不治本，换引物才是王道啊！

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3楼2016-01-15 11:21:31
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990104036

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我只想问问你跑的什么胶？以前没见过这样的胶。

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跟党走，有肉吃。
8楼2016-01-15 13:50:36
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普通回帖

当归加首乌

新虫 (初入文坛)
哦，对了，还有就是引物从2ul加到了4ul。
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总是记不起密码~~~
2楼2016-01-15 11:19:03
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
没看见高保真酶扩增出来了，按道理Taq的扩增效率是最强的啊~没理由扩不出来……

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4楼2016-01-15 11:23:26
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ccqqsunshine

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
把变性温度升高，退火温度降低

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5楼2016-01-15 11:28:56
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当归加首乌

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-15 11:23:26
没看见高保真酶扩增出来了，按道理Taq的扩增效率是最强的啊~没理由扩不出来……

高保真酶扩增的图没有放上来

这个是普通酶扩增的。。。。扩不出来啊
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总是记不起密码~~~
6楼2016-01-15 12:41:51
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当归加首乌

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ccqqsunshine at 2016-01-15 11:28:56
把变性温度升高，退火温度降低

嗯嗯，尝试了变性温度升高，但是退火温度没降。没有出来，我会再试一下的，谢谢。
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总是记不起密码~~~
7楼2016-01-15 12:43:18
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-01-15 22:29:03
根据你的描述，高保真酶是可以成功扩增的；
你可以考虑试剂的问题，dNTP 和 Taq酶的问题；
以前遇到很多次dNTP 出问题的情况，并且你的扩增貌似连引物二聚体都没有，估计是dNTP的问题；
可以考虑更换其他批次实验。
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9楼2016-01-15 16:18:36
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jackyoung

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-15 22:29:48
估计是高GC吧，高保真酶一般对buffer 各种优化过，普通酶不行的话可以试着加入6%的DMSO，看看效果。

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CestLaVie
10楼2016-01-15 19:59:30
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