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921206

新虫 (初入文坛)

[交流] 原核基因敲除 已有3人参与

最近刚开始做原核敲除,对质粒进行PCR后DpnI消除模板,结果会有两条带,暂且命名为上,和DpnI消化产物,对其都回收后发现bp相近,那哪个是消化好的呢?求大神指教,图1左200bp DNA ladder,DpnI消化产物,双酶切。图2左MAKER,DpnI胶回收,酶切回收,上回收

原核基因敲除


原核基因敲除-1


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pursuream

至尊木虫 (正式写手)


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引用回帖:
7楼: Originally posted by 921206 at 2016-01-15 13:33:37
用DpnI消完模板后还要双酶切,重新构建质粒,和cas9质粒共同导入菌内,诱导切割重组,消除质粒,然后切掉目的基因,师姐讲了一遍,我大概理解这个样子
...

你问的是质粒构建问题,和敲除无关。
DpnI只是去除模板,跟你产物又无关;位置不同的两条带,回收以后又跑到一起啦?如果是这样,我猜测,上面条带是你PCR产物DNA结合蛋白比如DpnI或别的什么造成,与下面条带没什么区别,你都收了就好。
如果我理解的不对,你还是去问师姐吧…

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

8楼2016-01-15 17:04:29
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原海亮

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
楼主对质粒进行PCR是要做扩环点突变么?

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天空才是极限,我有信心飞的更高!
2楼2016-01-15 09:28:41
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921206

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-01-15 09:28:41
楼主对质粒进行PCR是要做扩环点突变么?

没接触过扩环点突变,用带有NGG序列引物对质粒扩增的,问一下,你做敲除吗

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3楼2016-01-15 12:30:22
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原海亮

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 921206 at 2016-01-15 12:30:22
没接触过扩环点突变,用带有NGG序列引物对质粒扩增的,问一下,你做敲除吗
...

做过敲除,只是不太懂你这些操作和基因敲除的关系,倒和我们经常做的点突变挺像

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天空才是极限,我有信心飞的更高!
4楼2016-01-15 12:31:53
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