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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请大家帮我分析下细菌核酸抽提的问题吧，都提了5次了
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liupeng5182

金虫 (正式写手)

教授

[交流] 请大家帮我分析下细菌核酸抽提的问题吧，都提了5次了



这幅图片是我提的核酸的电泳条带。
方法是
1 离心过的样品用buffer重新混匀
2 加入SDS，最终浓度为1%，65℃裂解30min
3 加入等体积的酚氯仿异戊醇，轻颠混匀，12000离心10min
4 取水相，加入等体积的氯仿异戊醇，轻颠混匀12000离心10min
5 取水相加+0.1倍体积的NaAc（3M），加入2倍体积预冷的乙醇，轻颠混匀。
6 13000离心30min，弃上清，70%乙醇洗涤
7 干燥后用TE溶解。

请大家帮我分析下前面的亮带是什么。我需要的目的条带应该是红线标记的地方的，为什么条带这么弱？是不是第二步有问题？DNA和蛋白质没分离，导致离心时DNA也沉淀了。
都提了5次了，每次都是这样的结果，大*贵的意见。

[ Last edited by liupeng5182 on 2008-9-28 at 08:47 ]
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1楼 2008-09-28 08:44:42
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wh7690703

木虫 (正式写手)
目的条带弱，提取的DNA不多，可能破壁不彻底，加点溶菌酶或蛋白酶K试试
有没有加RNAase A?
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2楼2008-09-28 11:08:41
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sumertansy

铜虫 (小有名气)
RNA啊
同意上面的，破壁不好
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3楼2008-09-28 11:40:59
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
菌名也不说，G+还是G-啊？应该是前者的可能性较大，同意楼上的。如果是 古菌的话，那么你最好液氮 冻融。


   DNA和蛋白质没分离，导致离心时DNA也沉淀了。
至于你说的这个就没有道理了
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2008-09-28 11:52:12
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liupeng5182

金虫 (正式写手)

教授
谢谢各位，这个应该是G-，之前我师兄提过一次，用16srDNA做过鉴定，差不多都是假单胞菌。没有用RNase A，倒是加过一次蛋白酶K，放70度的水浴里10min，但是效果也不理想。溶菌酶主要是对革兰氏阳性菌有作用吧，所以也没用。
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5楼2008-09-28 14:27:20
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wh7690703

木虫 (正式写手)
70度水浴的时候盛提取液最好是用玻璃管，不要用塑料离心管
塑料管导热性不是很好，可能馆内和关外温度不一致
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6楼2008-09-28 14:42:54
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
引用回帖:
Originally posted by liupeng5182 at 2008-9-28 14:27:
谢谢各位，这个应该是G-，之前我师兄提过一次，用16srDNA做过鉴定，差不多都是假单胞菌。没有用RNase A，倒是加过一次蛋白酶K，放70度的水浴里10min，但是效果也不理想。溶菌酶主要是对革兰氏阳性菌有作用吧，所以 ...

溶菌酶不是主要对革兰氏阳性菌有作用，是对阴和阳性菌都有作用，不过是阴性菌的细胞壁比较薄，好破。所以一般不用加就能取得比较好的效果。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
7楼2008-09-28 17:20:27
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