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liupeng5182

金虫 (正式写手)

教授


[交流] 请大家帮我分析下细菌核酸抽提的问题吧,都提了5次了



这幅图片是我提的核酸的电泳条带。
方法是
1 离心过的样品用buffer重新混匀
2 加入SDS,最终浓度为1%,65℃裂解30min
3 加入等体积的酚氯仿异戊醇,轻颠混匀,12000离心10min
4 取水相,加入等体积的氯仿异戊醇,轻颠混匀12000离心10min
5 取水相加+0.1倍体积的NaAc(3M),加入2倍体积预冷的乙醇,轻颠混匀。
6 13000离心30min,弃上清,70%乙醇洗涤
7 干燥后用TE溶解。

请大家帮我分析下前面的亮带是什么。我需要的目的条带应该是红线标记的地方的,为什么条带这么弱?是不是第二步有问题?DNA和蛋白质没分离,导致离心时DNA也沉淀了。
都提了5次了,每次都是这样的结果,大*贵的意见。

[ Last edited by liupeng5182 on 2008-9-28 at 08:47 ]
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wh7690703

木虫 (正式写手)

目的条带弱,提取的DNA不多,可能破壁不彻底,加点溶菌酶或蛋白酶K试试
有没有加RNAase A?
2楼2008-09-28 11:08:41
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sumertansy

铜虫 (小有名气)

RNA啊
同意上面的,破壁不好
3楼2008-09-28 11:40:59
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

菌名也不说,G+还是G-啊?应该是前者的可能性较大,同意楼上的。如果是 古菌的话,那么你最好液氮 冻融。


   DNA和蛋白质没分离,导致离心时DNA也沉淀了。
至于你说的这个就没有道理了
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2008-09-28 11:52:12
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liupeng5182

金虫 (正式写手)

教授


谢谢各位,这个应该是G-,之前我师兄提过一次,用16srDNA做过鉴定,差不多都是假单胞菌。没有用RNase A,倒是加过一次蛋白酶K,放70度的水浴里10min,但是效果也不理想。溶菌酶主要是对革兰氏阳性菌有作用吧,所以也没用。
5楼2008-09-28 14:27:20
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wh7690703

木虫 (正式写手)

70度水浴的时候盛提取液最好是用玻璃管,不要用塑料离心管
塑料管导热性不是很好,可能馆内和关外温度不一致
6楼2008-09-28 14:42:54
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

引用回帖:
Originally posted by liupeng5182 at 2008-9-28 14:27:
谢谢各位,这个应该是G-,之前我师兄提过一次,用16srDNA做过鉴定,差不多都是假单胞菌。没有用RNase A,倒是加过一次蛋白酶K,放70度的水浴里10min,但是效果也不理想。溶菌酶主要是对革兰氏阳性菌有作用吧,所以 ...

溶菌酶不是主要对革兰氏阳性菌有作用,是对阴和阳性菌都有作用,不过是阴性菌的细胞壁比较薄,好破。所以一般不用加就能取得比较好的效果。
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
7楼2008-09-28 17:20:27
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