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体外转录检测敏感性问题
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| 本人投了一篇文章，由于做的病毒体外极难培养，且是RNA病毒，故从病料中提取RNA后，经PCR扩增后克隆于pMD18-T上，稀释重组质粒换算拷贝数以检测病毒敏感性，而报社编辑说：实验中存在技术性缺陷，即检测 RNA 病毒却采用重组质粒（ DNA ）作为模板进行标准曲线建立和敏感性试验，由于 RNA 在反转录制备 cDNA 过程中的效率并不是 100% ，对于不能够体外培养的 RNA 病毒，则可以通过检测的靶基因克隆于含有体外转录的 T7 或 T3 启动子质粒中（如 pGEM-T 系列质粒），提取含有目的基因的重组质粒，检测其相关的 OD 值，通过公式计算其重组质粒的拷贝数后，采用体外转录试剂盒进行 RNA 的转录。将体外制备的 RNA 转录为模板进行反转录，制备 cDNA ，并将其进行倍比系列稀释，分别以不同稀释度的 cDNA 作为模板进行荧光定量 PCR 扩增确定其检测的敏感性。 我的问题是：1.直接拿体外转录获得的RNA进行稀释来做敏感性试验不行吗？为什么要用它再次反转录cDNA来检测敏感性？ 这么做严谨吗？ 2.体外转录获得的RNA再反转录成cDNA这样折腾一遍不是跟编辑说的RNA 在反转录 cDNA 过程中的效率并不是 100%又一样了吗？ |
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