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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » western 检测tubulin，imageJ无法识别后面5个条带。
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tylll

铜虫 (初入文坛)

[求助] western 检测tubulin，imageJ无法识别后面5个条带。

大家好，我刚做western blot ，用ECL曝tubulin（42kD），曝光10s，条带有亮有浅。用imageJ检测灰度，
问题来了：浅色条带可以用魔棒（wand）检测出来，而后面亮的条带无法用wand检测，圈框大小一致，请问是什么原因呢？
            我同时用imageJ检测了同一张膜上的pMLC（18kD），也是后面的5个条带无法检测，请大家指点。

western条件：20ug上样量，垂直电泳（90V，20min；125V 至胶底），半干转40mA 、30min，5%Blocker 的TBST 室温封闭1-1.5h，一抗过夜，TBST 5min洗3次，二抗室温封闭1h，TBST 5min洗3次，ECL处理5min，曝光时间为5s、10s、自动，做过几次，结果条带都不好，请大家指点。

western 检测tubulin，imageJ无法识别后面5个条带。
tubulin 自动曝光（1.5min） 20151212_122522_Ch+Marker.jpg


western 检测tubulin，imageJ无法识别后面5个条带。-1
pMLC 自动曝光（1.5min） 20151212_121417_Ch+Marker.jpg
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上弦月
1楼 2015-12-14 13:06:26
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晴天1882

木虫 (正式写手)
你这胶上怎么会有条带？
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人有绝交，才有至交！
2楼2015-12-14 15:51:18
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诗诺初夏

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
3楼2015-12-14 15:59:30
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tylll

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晴天1882 at 2015-12-14 15:51:18
你这胶上怎么会有条带？

这就是膜呀，PVDF膜，0.45um孔径的
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上弦月
4楼2015-12-14 18:21:42
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tylll

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 诗诺初夏 at 2015-12-14 15:59:30
我以为是膜呢

就是PVDF膜，不是胶。
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上弦月
5楼2015-12-14 18:22:24
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
条带挺好的，别用魔棒，就圈框然后再扣除背景
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
6楼2015-12-15 00:53:17
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tylll

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-12-15 00:53:17
条带挺好的，别用魔棒，就圈框然后再扣除背景

背景值不准，不同地方的背景数值不样，有些背景和检测的条带灰度值相当，因此才用了魔棒。我这周在尝试降低一抗和二抗的浓度并减少封闭时间，不知道效果怎么样？
弱弱的问一句，曝光时需要在膜下垫一些塑料薄膜之类的东西么？
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上弦月
7楼2015-12-15 09:59:38
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匿名

用户注销 (正式写手)
本帖仅楼主可见
8楼2015-12-21 23:52:11
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tylll

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by becklittle at 2015-12-21 23:52:11
看着好像胶啊
...

之前不懂用黑色背景，用白色背景就显得像胶
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上弦月
9楼2015-12-22 18:56:27
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