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崩溃了，求助RT-PCR
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做了快两个月的RT，一直做的不好。 我是处理细胞后，测定细胞c-myc的表达变化。 前期是用没有处理的细胞摸条件，不太稳定，有时出，有时不出。而且我的大部分是要么内参，目的都不出；要么都出。要么一出条带就很漂亮，要么啥都没有。摸温度也是，要么那几个温度都出，亮度也差不多，要么什么都没有，有是连引物二聚体也没有。后来我调整了引物，模板量。把引物加倍。其中单独引物加倍，或者引物、模板都加倍的情况比较稳定。 我以为就可以了，然后处理细胞。结果一到正式做的时候又不稳定了，有时有，有时没。 开始以为是提取的问题，可是每次提取的时候都测定浓度，都跑电泳。比值大约在2，电泳条带也是三条都有，28S是18S的两倍，5S很淡。觉得提取应该没有问题。然后是PCR，我后来用TAKARA的试剂盒，可还是出现不稳定。首先用试剂盒，加样的误差也不大。而且用试剂盒作出来过，还是新分装的，应该也不会有多大问题。 我一直在想是不是反转录的问题，用的TAKARA的MMLV，按照说明操作，每次上样500ng。我不知道怎样检测反转录成工了，有人说用内参，要是内参没有出的话，是不是代表没转录成功。感觉也很少有人在反转录出问题。大多人好象是内参出了，目的没出。 时间也不多了，钱也花了不少，还做不出来。马上要毕业了，实在是着急。 请各位老师朋友指点指点，谢谢！ |
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