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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 多抗制备的详细步骤。
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sun133

木虫 (小有名气)

[求助] 多抗制备的详细步骤。 已有1人参与

虫友们，谁有制取多抗的标准步骤？我写了一个给我的老师，他说过于简单，我没办法了！求帮助！

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为梦想加油！
1楼 2015-12-09 09:32:04
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的步骤是怎么写的？如果不是论文，只是操作过程的话，一般来说就那几个步骤，如下：
实验一  免疫血清的制备
一、实验目的
   熟悉免疫血清的制备过程；
   了解动物实验的基本知识。
二、实验原理
    将抗原物质经适当途径，按照预先制定的免疫方案免疫动物，经过一定时间，可刺激机体产生特异抗体并释放入血液，当血中抗体达到一定效价时采血，分离血清，即为特异性免疫血清（又称为抗血清）。因抗原具有多种表位，可激活多个克隆的B细胞活化产生抗体，因此，这种免疫血清又称为多克隆抗体。
    本实验以绵羊红细胞（SRBC）作为免疫原，以家兔为免疫动物，制备兔抗养红细胞免疫血清（也称为溶血素）
三、器材和材料
1.动物  健康成年家兔，雄性，体重2-3kg；健康成年绵羊。
2.试剂  生理盐水、碘酒、75%酒精。
3.器材  剪刀、镊子、无菌注射器、量筒、无菌毛细滴管、无菌试管、离心管、三角烧瓶（200ml）、动物固定架、手术器械一套、塑料放血管等。
四、实验步骤
1.抗原制备
（1）用碘酒和75% 消毒绵羊皮肤，抽取颈静脉血液，注入含有等量阿氏液的三角烧瓶内，混匀。阿氏液既有抗凝作用，又适于储存SRBC。分装后置4℃冰箱内，可使用3周。
（2）无菌取上述绵羊血于离心管中，用无菌生理盐水洗涤红细胞，2000r/min，离心5min，吸弃上清液和白细胞层，再用无菌生理盐水与SRBC混匀， 2000r/min，离心5min，重复3次。最后一次离心10min，以使血细胞沉积于管底，弃去上清液。 （3）根据红细胞积压，用生理盐水配成20%SRBC悬液。
2.免疫动物
（1）全班分为4组，每组选择健康雄性兔1只，用于免疫。
（2）用全血和SRBC悬液按下述方案免疫兔子。

（3）试血
末次注射后第7天，耳静脉采血1ml ,分离血清，用试管凝集试验滴定效价。（1：2000以上可用）
3、分离血清
（1）  颈动脉放血（心脏采血）并收集于无菌三角烧瓶中凝固后4℃冰箱过夜，分离上层血清。然后2500r/min离心10min，收集收集上层血清。
（2）收集的血清经鉴定纯化后，小量分装，-20℃冻存。
五、实验结果
  收获的血清应无菌，且无溶血现象。兔抗SRBC免疫血清的溶血效价应高于1：2000；兔抗人IgG免疫血清的效价应高于1：16。
六、注意事项
抗原制备、免疫动物及采集血清等过程应注意菌操作；
免疫的途径、次数、间隔时间因抗原性状不同而异，应合理设计免疫方案，并更具具体情况加以调整；
再次注射免疫原时，要防治过敏反应发生。

顶多再写一些后续的抗体蛋白纯化的步骤，该不会你还要写抗原的制备吧？
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
2楼2015-12-09 10:13:44
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

或者这个：
一、器材
剪刀（剪兔毛用）一把、弯头眼科手术镊子（游离血管用）一把、直头眼科手术剪（剪血管用）一把，手术刀架，手术刀片，注射器（1ml、10ml，25ml）附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶（200ml）或平皿（直径450px）、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。

二、试剂
生理盐水（或PBS）
弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant，FCA）
弗氏不完全佐剂（Freund’s incomplete adjuvant，FIA）
二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3

三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。

四、兔子的选择
兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。

五、免疫
用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。

注：
抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射（不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好）。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。

六、取血：
免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。
前几次取血用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。

最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下：
1、家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。
2、沿颈部中线用手术刀切开皮肤约250px，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌（小心操作，如碰到小血管出血，可用止血钳止血）。
3、用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织。
4、于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住。
5、用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口（勿剪断），插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。
6、松开止血钳，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。

七、血清的分离
如果用三角瓶或平皿盛血，将器皿倾斜放置于37oC烘箱2h，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集，37oC烘箱放置2h，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上离心，10000RCF，10分钟。在血清中加入NaN3 至终浓度0.02%，分装后-20oC保存。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
3楼2015-12-09 10:18:20
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