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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » TA克隆过程中的困惑
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heianduck

金虫 (正式写手)

[求助] TA克隆过程中的困惑 已有4人参与

最近在做TA克隆，一直纠结空载率的问题：同一批做的样本，里面有3个客户，有2个客户还好，空载不怎么多，但是有个客户的空载率非常的高，都已经过半了。然后我查了些资料，说是客户的样本有问题；各位大神，我想问下还有没有其他原因？如果是客户的样本问题的话，那会是什么样的样本会致使空载率高呢？
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1楼 2015-11-30 11:38:02
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~春梦秋云~

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
现在用一步克隆法，据说克隆效率很高啊！

发自小木虫Android客户端
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相信黎明不会失约，相信付出必有回报！
2楼2015-11-30 13:40:32
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iayala

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
heianduck: 金币+1, ★有帮助 2016-01-05 08:19:31
是客户委托您将他们的目的片段做TA克隆吗？可能您是TA克隆实验的主体和被空载困扰的人？
一般来讲，目的片段越长，越不容易连接上载体。
还有，挑菌菌p时使用质粒自带的测序引物，比如M13引物，可以防止菌p的假阳性。
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3楼2015-12-01 08:36:30
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
heianduck: 金币+1, ★有帮助 2016-01-05 08:19:40
提供几个可能原因：
1. 目的片段太长，连接效率较低；
2. 客户所提供的是PCR产物么？如果是可能聚合酶的原因没有加A哦，那样会严重影响TA克隆的；
3. 如果不是用的一批载体，也可能是载体的原因，我遇到过T载体提供的连接液错误。



祝好
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没有做不到，只有想不到！
4楼2015-12-01 11:45:24
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heianduck

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-12-01 11:45:24
提供几个可能原因：
1. 目的片段太长，连接效率较低；
2. 客户所提供的是PCR产物么？如果是可能聚合酶的原因没有加A哦，那样会严重影响TA克隆的；
3. 如果不是用的一批载体，也可能是载体的原因，我遇到过T载体提 ...

目的片段750，比他长的连的都比较好；客户的PCR未纯化是加了A的，实验前打电话确认的；同一批做的样本，用的是同一批载体
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5楼2015-12-01 12:11:22
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fuyulin

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
heianduck: 金币+8, ★★★很有帮助 2016-01-05 08:19:56
调节一下载体和外源片段的比例到1：3；
减少载体用量；
增加筛选抗生素浓度；
外源基因也有可能本身有毒性，插入的把细菌杀死。
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6楼2015-12-01 12:17:18
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