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tonyde

新虫 (初入文坛)

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虫号: 4252656
注册: 2015-11-28
专业: 生物化学

[求助] 构建RNAi植物表达载体，连接多次失败，向各位前辈求助！已有2人参与

构建RNAi植物表达载体，连接多次失败，我把遇到的情况列了一下，希望有经验前辈们帮忙分析一下原因！
1.目的片段（一个基因的正向片段加内含子加反向片段）之前已经连到中间载体上了，目的片段大小为1200bp，植物表达载体11600bp
2.酶切位点用的是Apa I和BamH I
3.连接体系10uL和20uL都试过，载体和片段比例从1:6到1:10也都试过，T4连接酶是NEB的
4.连了好几次，一开始板上不长菌，后来长菌了，菌液PCR也有带，提质粒大小竟然是4000bp左右（真是神奇），用Apa I和BamH I切后有两条带，一条900bp左右，一条1100-1200bp左右（更神奇了

）。再后来还有一种情况，板上长菌，提出质粒后大小12000bp左右（大小是对的），但是提质粒，质粒PCR全都没有带。
5.已发现的问题：
表达载体用Apa I单酶切的时候会切下来一条2000bp左右的带（但是载体图谱里只有一个Apa I酶切位点），这个载体是向其他实验室要的，他们之前做过跟我一样的实验（酶切位点都一样，只有基因不一样），但是他们的论文里没说这个载体有2个Apa I位点啊！

各位大神们，提出质粒4000bp是怎么回事？连的不对是不是我的表达载体有问题啊？

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