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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 构建RNAi植物表达载体，连接多次失败，向各位前辈求助！
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tonyde

新虫 (初入文坛)

[求助] 构建RNAi植物表达载体，连接多次失败，向各位前辈求助！ 已有2人参与

构建RNAi植物表达载体，连接多次失败，我把遇到的情况列了一下，希望有经验前辈们帮忙分析一下原因！
1.目的片段（一个基因的正向片段加内含子加反向片段）之前已经连到中间载体上了，目的片段大小为1200bp，植物表达载体11600bp
2.酶切位点用的是Apa I和BamH I
3.连接体系10uL和20uL都试过，载体和片段比例从1:6到1:10也都试过，T4连接酶是NEB的
4.连了好几次，一开始板上不长菌，后来长菌了，菌液PCR也有带，提质粒大小竟然是4000bp左右（真是神奇），用Apa I和BamH I切后有两条带，一条900bp左右，一条1100-1200bp左右（更神奇了）。再后来还有一种情况，板上长菌，提出质粒后大小12000bp左右（大小是对的），但是提质粒，质粒PCR全都没有带。
5.已发现的问题：
表达载体用Apa I单酶切的时候会切下来一条2000bp左右的带（但是载体图谱里只有一个Apa I酶切位点），这个载体是向其他实验室要的，他们之前做过跟我一样的实验（酶切位点都一样，只有基因不一样），但是他们的论文里没说这个载体有2个Apa I位点啊！

各位大神们，提出质粒4000bp是怎么回事？连的不对是不是我的表达载体有问题啊？
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1楼 2015-11-28 19:44:45
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DNTP

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

把质粒提出来送公司测个序看看吧
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2楼2015-12-10 20:10:58
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xiaoma顶你

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问楼主，你的问题现在解决了没？我现在也在做植物的RNAi，不知道内含子怎么找，还望赐教！
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3楼2016-03-14 16:20:23
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