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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 小弟想把一个200bp的目的片段连接到6900的载体上，
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luhuipeng

金虫 (初入文坛)

[求助] 小弟想把一个200bp的目的片段连接到6900的载体上， 已有3人参与

小弟想把一个200bp的目的片段连接到6900的载体上，用的sal1和xho1 的同位酶。做了一个半月了没有结果，求哥哥姐姐们给予帮助啊，谢谢啊，载体：目的片段是1:7，还做个1:10都不行，不知道该如何是好了
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1楼 2015-11-28 11:27:28
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yangxianyou

新虫 (小有名气)
只要载体和目的片段对应的两个酶都切开了，所用的链接酶没有问题，用超感，肯定可以的。若是转化后长菌的，但菌检不到阳性结果：
建议重新去做双没切
若是转化后不长菌的：建议跟换连接酶和超感
载体重构肯定可以做成的，加油！

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2楼2015-11-28 11:42:56
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普通回帖

ddtao

新虫 (小有名气)
应用于基因治疗的的载体主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体转染效率高,是目前体内基因治疗的主要工具,但存在潜在感染、免疫原性等缺点,在体内不能重复使用,并且携带目的基因的大小受到限制。非病毒载体具有安全性高、无免疫原性、制备简单、易于对DNA进行操作等特点,已经越来越受到人们的重视。但非病毒载体转染效率过去一直不如病毒载体。
现在我国成功构建了安全、高效、廉价的非病毒载体，其转染效率高于黄金标准PEI。
From   huiyisu@126.com
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3楼2015-11-28 12:03:43
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luhuipeng

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangxianyou at 2015-11-28 11:42:56
只要载体和目的片段对应的两个酶都切开了，所用的链接酶没有问题，用超感，肯定可以的。若是转化后长菌的，但菌检不到阳性结果：
建议重新去做双没切
若是转化后不长菌的：建议跟换连接酶和超感
载体重构肯定可以做 ...

长出来的菌不是很多，只有二三十个，但是双酶切，切不出来。用PCR扩增也没有结果。两个酶都可以单切载体，限制酶应该是没有问题。我该怎么办啊
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4楼2015-11-28 12:14:25
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fmm123

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
luhuipeng: 金币+1 2015-12-04 22:12:01
多连几次，总会成功的。
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5楼2015-11-28 12:45:26
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wanyiku

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试试诺唯赞的同源重组酶，不需要酶切位点，构建极易成功，联系方式18824717371，QQ1204541770
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加油，你是最棒的
6楼2015-11-28 14:59:49
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15853830932

木虫 (小有名气)
买个infusion试剂盒好了，巨简单

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If you shed tear when you miss the sun, you also miss the stars.
7楼2015-11-28 16:53:52
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
8楼2015-11-28 23:51:53
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luhuipeng

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by mataomatao at 2015-11-28 23:51:53
pcr 产物，载体酶切不彻底？之后胶回收了？

不是特别彻底，有那么一点，载体切下来的前段只有十几BP直接用纯化试剂盒纯化的。不是说没切时间太长不好吗，我切了8个小时

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9楼2015-11-29 12:00:04
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
10楼2015-11-29 12:01:19
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