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luhuipeng

金虫 (初入文坛)

[求助] 小弟想把一个200bp的目的片段连接到6900的载体上, 已有3人参与

小弟想把一个200bp的目的片段连接到6900的载体上,用的sal1和xho1 的同位酶。做了一个半月了没有结果,求哥哥姐姐们给予帮助啊,谢谢啊,载体:目的片段是1:7,还做个1:10都不行,不知道该如何是好了
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luhuipeng

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by mataomatao at 2015-11-28 23:51:53
pcr 产物,载体酶切不彻底?之后胶回收了?

不是特别彻底,有那么一点,载体切下来的前段只有十几BP直接用纯化试剂盒纯化的。不是说没切时间太长不好吗,我切了8个小时

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9楼2015-11-29 12:00:04
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yangxianyou

新虫 (小有名气)

只要载体和目的片段对应的两个酶都切开了,所用的链接酶没有问题,用超感,肯定可以的。若是转化后长菌的,但菌检不到阳性结果:
建议重新去做双没切
若是转化后不长菌的:建议跟换连接酶和超感
载体重构肯定可以做成的,加油!

发自小木虫Android客户端
2楼2015-11-28 11:42:56
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ddtao

新虫 (小有名气)


应用于基因治疗的的载体主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体转染效率高,是目前体内基因治疗的主要工具,但存在潜在感染、免疫原性等缺点,在体内不能重复使用,并且携带目的基因的大小受到限制。非病毒载体具有安全性高、无免疫原性、制备简单、易于对DNA进行操作等特点,已经越来越受到人们的重视。但非病毒载体转染效率过去一直不如病毒载体。
现在我国成功构建了安全、高效、廉价的非病毒载体,其转染效率高于黄金标准PEI。
From   huiyisu@126.com
3楼2015-11-28 12:03:43
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luhuipeng

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yangxianyou at 2015-11-28 11:42:56
只要载体和目的片段对应的两个酶都切开了,所用的链接酶没有问题,用超感,肯定可以的。若是转化后长菌的,但菌检不到阳性结果:
建议重新去做双没切
若是转化后不长菌的:建议跟换连接酶和超感
载体重构肯定可以做 ...

长出来的菌不是很多,只有二三十个,但是双酶切,切不出来。用PCR扩增也没有结果。两个酶都可以单切载体,限制酶应该是没有问题。我该怎么办啊
4楼2015-11-28 12:14:25
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