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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教：这个qPCR结果怎么分析？
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merry2004120

银虫 (小有名气)

[求助] 请教：这个qPCR结果怎么分析？ 已有3人参与

本人刚开始做qPCR，不太会看曲线，请高手指点。
taqman法
粉紫色的曲线是内参，蓝色曲线是我的目的基因。
做的是两个正常样品，三副孔，但是它们的目的基因曲线上升趋势差异很大，这是什么原因？

请教：这个qPCR结果怎么分析？
Ct.png
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1楼 2015-11-23 09:47:36
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
merry2004120: 金币+3, ★有帮助 2015-11-25 10:31:01
内参做的还可以。两只兔子个体，该基因表达量有差异也是正常的吧，你可以同一只兔子分别提两个平行样看看有没有差异。对这个结果，Ct值偏低，你可以加大模板用量（别超过10%）看看效果，或者从样品处理及RNA提取-反转录的角度考虑下有没有问题，特别是两个样品，各步提取及反应效率是否一样。
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6楼2015-11-24 08:54:37
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普通回帖

S一缕阳光h

木虫 (著名写手)
正在学习中～～

发自小木虫Android客户端
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2楼2015-11-23 09:54:48
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lw19850128

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
平行做的有问题了吧？用枪的时候细心点，最好统一混一个体系在分装。
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3楼2015-11-23 09:57:33
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
能不能把曲线代表什么说清楚？除了粉色蓝色，还有几条线啊，不知道代表什么样品。
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4楼2015-11-23 15:19:42
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merry2004120

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by uulovelyuu at 2015-11-23 15:19:42
能不能把曲线代表什么说清楚？除了粉色蓝色，还有几条线啊，不知道代表什么样品。

用两只正常兔子做的qPCR，每只兔子设3副孔
所以，内参是6条曲线
奇怪的是，我的目的基因，两只正常兔子的曲线趋势不一样。
为什么两只正常兔子同一基因表达曲线会差别这么大？
下一步该怎么做？求指教。
请教：这个qPCR结果怎么分析？-1
Ct.png
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5楼2015-11-23 16:40:29
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merry2004120

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by uulovelyuu at 2015-11-24 08:54:37
内参做的还可以。两只兔子个体，该基因表达量有差异也是正常的吧，你可以同一只兔子分别提两个平行样看看有没有差异。对这个结果，Ct值偏低，你可以加大模板用量（别超过10%）看看效果，或者从样品处理及RNA提取-反 ...

同一只兔子提两个平行样是要排除操作误差吗？
之前，我分两次提了四只正常兔子，分两次做的qPCR结果也是一个曲线斜率大，一个曲线比较低平。每次都是同时提取、RT、qPCR，但曲线就是出现不同的趋势。很让我郁闷！

我RT体系20ul，RNA加1000ng
qPCR体系20ul，cDNA加1ul

是不是将cDNA增加到2ul？
如果没有太大变化，将RT时RNA量增加到2000ng，是这样改进吗？

请问，反应效率怎么看？
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7楼2015-11-25 10:30:14
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
结果可以呀，表达有差异
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8楼2015-11-25 15:49:00
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z631535213

木虫 (正式写手)
Mark下，正在学这个，以后有问题请教下楼主
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9楼2015-11-25 16:30:01
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merry2004120

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by viki_MDK at 2015-11-25 15:49:00
结果可以呀，表达有差异

表达不应该出现差异的——结果很不理想
都是正常兔的组织，同属于实验对照组
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10楼2015-11-26 08:03:39
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