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merry2004120

银虫 (小有名气)

[求助] 请教:这个qPCR结果怎么分析? 已有3人参与

本人刚开始做qPCR,不太会看曲线,请高手指点。
taqman法
粉紫色的曲线是内参,蓝色曲线是我的目的基因。
做的是两个正常样品,三副孔,但是它们的目的基因曲线上升趋势差异很大,这是什么原因?

请教:这个qPCR结果怎么分析?
Ct.png
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
merry2004120: 金币+3, 有帮助 2015-11-25 10:31:01
内参做的还可以。两只兔子个体,该基因表达量有差异也是正常的吧,你可以同一只兔子分别提两个平行样看看有没有差异。对这个结果,Ct值偏低,你可以加大模板用量(别超过10%)看看效果,或者从样品处理及RNA提取-反转录的角度考虑下有没有问题,特别是两个样品,各步提取及反应效率是否一样。
6楼2015-11-24 08:54:37
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普通回帖

S一缕阳光h

木虫 (著名写手)

2楼2015-11-23 09:54:48
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lw19850128

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
平行做的有问题了吧?用枪的时候细心点,最好统一混一个体系在分装。
3楼2015-11-23 09:57:33
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
能不能把曲线代表什么说清楚?除了粉色蓝色,还有几条线啊,不知道代表什么样品。
4楼2015-11-23 15:19:42
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merry2004120

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by uulovelyuu at 2015-11-23 15:19:42
能不能把曲线代表什么说清楚?除了粉色蓝色,还有几条线啊,不知道代表什么样品。

用两只正常兔子做的qPCR,每只兔子设3副孔
所以,内参是6条曲线
奇怪的是,我的目的基因,两只正常兔子的曲线趋势不一样。
为什么两只正常兔子同一基因表达曲线会差别这么大?
下一步该怎么做?求指教。
请教:这个qPCR结果怎么分析?-1
Ct.png

5楼2015-11-23 16:40:29
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merry2004120

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by uulovelyuu at 2015-11-24 08:54:37
内参做的还可以。两只兔子个体,该基因表达量有差异也是正常的吧,你可以同一只兔子分别提两个平行样看看有没有差异。对这个结果,Ct值偏低,你可以加大模板用量(别超过10%)看看效果,或者从样品处理及RNA提取-反 ...

同一只兔子提两个平行样是要排除操作误差吗?
之前,我分两次提了四只正常兔子,分两次做的qPCR结果也是一个曲线斜率大,一个曲线比较低平。每次都是同时提取、RT、qPCR,但曲线就是出现不同的趋势。很让我郁闷!

我RT体系20ul,RNA加1000ng
qPCR体系20ul,cDNA加1ul

是不是将cDNA增加到2ul?
如果没有太大变化,将RT时RNA量增加到2000ng,是这样改进吗?

请问,反应效率怎么看?
7楼2015-11-25 10:30:14
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
结果可以呀,表达有差异
8楼2015-11-25 15:49:00
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z631535213

木虫 (正式写手)

Mark下,正在学这个,以后有问题请教下楼主
9楼2015-11-25 16:30:01
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merry2004120

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by viki_MDK at 2015-11-25 15:49:00
结果可以呀,表达有差异

表达不应该出现差异的——结果很不理想
都是正常兔的组织,同属于实验对照组
10楼2015-11-26 08:03:39
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