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z631535213

木虫 (正式写手)

[求助] PCR终于成功了,但是温差12°的梯度PCR每个梯度都有产物 已有2人参与

楼主做从42°到54°做了7组梯度  42°,44°,46°,48°,50°,52°,54°,自右向左,每个温度2个样。
跑胶上看好像都有产物,理论上也和设计的长度一样  100bp。


想请问下各位
1.有没有比跑胶更加准确点的检测产物的方法啊?我只知道测序,但是实验量太多,好像不大可取。
2.这么宽的温度梯度进行PCR都有产物,而且好像也没有非特异性的扩增,有没有可能啊。
3.Mark是50,100,200,250,300...每个跑道最前方是不是残留的引物啊?25ul体系里我设置的引物终浓度为0.3ul,30 cycles,用不用再降低点?

PCR终于成功了,但是温差12°的梯度PCR每个梯度都有产物
IMG_0610.JPG
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pursuream

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
2,很正常。
其实如果做构建的话,100bp你可以直接订两条引物,设计出和酶切后一样的粘性末端,退个火就直接连接了。。

发自小木虫Android客户端
3楼2015-11-20 21:35:24
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liuxinyueer

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
z631535213: 金币+20, ★★★很有帮助, 10 2015-11-20 22:54:58
1,可以用限制性内切酶切一下,再跑胶,检测是否为目的条带
2,很有可能,因为扩增片段较短,引物与模板的选择性结合位点少
3,最前面是引物二聚体,可通过重新设计引物解决
欢迎讨论,小木虫未能及时回复,请邮箱: lmzhang1994@gmail.com
2楼2015-11-20 21:25:47
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z631535213

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by pursuream at 2015-11-20 21:35:24
2,很正常。
其实如果做构建的话,100bp你可以直接订两条引物,设计出和酶切后一样的粘性末端,退个火就直接连接了。。

楼主设计的是多重引物 4对。这个是检测其中的一对引物设计的行不行,所以订两条引物可行性不大啊
4楼2015-11-20 22:52:07
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张正禹

新虫 (小有名气)

可以考虑再升高退火温度,特异性就更强了,杂带就会减少,而且54度退火温度也不高,我用过60度

发自小木虫Android客户端
5楼2015-11-20 23:37:27
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