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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR终于成功了，但是温差12°的梯度PCR每个梯度都有产物
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z631535213

木虫 (正式写手)

[求助] PCR终于成功了，但是温差12°的梯度PCR每个梯度都有产物 已有2人参与

楼主做从42°到54°做了7组梯度  42°，44°，46°，48°，50°，52°，54°，自右向左，每个温度2个样。
跑胶上看好像都有产物，理论上也和设计的长度一样  100bp。


想请问下各位
1.有没有比跑胶更加准确点的检测产物的方法啊？我只知道测序，但是实验量太多，好像不大可取。
2.这么宽的温度梯度进行PCR都有产物，而且好像也没有非特异性的扩增，有没有可能啊。
3.Mark是50，100，200，250，300...每个跑道最前方是不是残留的引物啊？25ul体系里我设置的引物终浓度为0.3ul，30 cycles，用不用再降低点？

PCR终于成功了，但是温差12°的梯度PCR每个梯度都有产物
IMG_0610.JPG
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1楼 2015-11-20 17:33:38
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liuxinyueer

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
z631535213: 金币+20, ★★★很有帮助, 10 2015-11-20 22:54:58
1，可以用限制性内切酶切一下，再跑胶，检测是否为目的条带
2，很有可能，因为扩增片段较短，引物与模板的选择性结合位点少
3，最前面是引物二聚体，可通过重新设计引物解决
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欢迎讨论，小木虫未能及时回复，请邮箱: lmzhang1994@gmail.com
2楼2015-11-20 21:25:47
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pursuream

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
2，很正常。
其实如果做构建的话，100bp你可以直接订两条引物，设计出和酶切后一样的粘性末端，退个火就直接连接了。。

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3楼2015-11-20 21:35:24
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z631535213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by pursuream at 2015-11-20 21:35:24
2，很正常。
其实如果做构建的话，100bp你可以直接订两条引物，设计出和酶切后一样的粘性末端，退个火就直接连接了。。

楼主设计的是多重引物 4对。这个是检测其中的一对引物设计的行不行，所以订两条引物可行性不大啊
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4楼2015-11-20 22:52:07
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张正禹

新虫 (小有名气)
可以考虑再升高退火温度，特异性就更强了，杂带就会减少，而且54度退火温度也不高，我用过60度

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5楼2015-11-20 23:37:27
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