多次pcr均无法获得大量的目的 - 分子生物 - PCR相关 - 第2页小木虫论坛-学术科研互动平台

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6827089

金虫 (正式写手)

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可以回收暗的条带当模板，再pcr

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11楼2015-11-18 13:14:28

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科学小覃

木虫 (正式写手)

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有些复杂模版的基因很难变性，可加入变性促进剂如DMSO，或提高变性温度，98度30秒，另外设计退火温度高一点的引物，最好60以上。

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生物科学

12楼2015-11-18 13:30:20

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骑驴诗人

新虫 (初入文坛)

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1楼: Originally posted by 李豆豆416 at 2015-11-17 15:58:06
有一段基因序列，始终pcr不出来，模版没有问题，引物换了好几对，也做过梯度，可是条带很暗，无法纯化，这是什么原因？请大家赐教

加一下循环或模版量试一下

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13楼2015-11-18 13:36:36

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李豆豆416

铁虫 (小有名气)

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9楼: Originally posted by wyfdgg at 2015-11-18 10:50:54
模板是质粒还是？...

是cDNA

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14楼2015-11-18 14:15:56

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李豆豆416

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11楼: Originally posted by 6827089 at 2015-11-18 13:14:28
可以回收暗的条带当模板，再pcr

试过了，出现拖带很严重

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15楼2015-11-18 14:17:21

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李豆豆416

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12楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-11-18 13:30:20
有些复杂模版的基因很难变性，可加入变性促进剂如DMSO，或提高变性温度，98度30秒，另外设计退火温度高一点的引物，最好60以上。

基因中的AT含量很高

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16楼2015-11-18 14:17:57

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valkeyyu

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1.引物和模板的同源性有多大
2.PCR反应试剂是否正常工作
3.引物本身的立体结构，或者两条引物之间是否形成高次结构
4.仪器和反应条件

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人间正道是沧桑

17楼2015-11-18 16:54:30

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甜甜的89

木虫 (小有名气)

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切胶回收做模板

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加油

18楼2015-11-18 16:58:46

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科学小覃

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16楼: Originally posted by 李豆豆416 at 2015-11-18 14:17:57
基因中的AT含量很高
...

AT或GC不管哪个偏高都会容易链内互补的二级结构，所以要提高退火温度

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生物科学

19楼2015-11-19 08:13:02

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李豆豆416

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19楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-11-19 08:13:02
AT或GC不管哪个偏高都会容易链内互补的二级结构，所以要提高退火温度...

但是，引物的tm值还不到50

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20楼2015-11-19 09:24:43

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