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[求助]
求助,搭桥pcr
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我现在要搭两个前段,一个是2.3kb一个是2.4kb,有点长,现在搭桥搭不出来。 第一,因为我们是中间定点突变的,所以只能从这儿分。我们之前已经用我们的酶顺利p出了全长,所以肯定不是酶的问题了。 第二,中间大约有24个重复碱基,长度应该也够了。 第三,我们p两段的时候,还是很顺利的,也很单一。只是pcr大量的时候,我先点2微升检测,大小正确,然后把其余的一百多微升一起点往后,条带大小变小了。因此胶回收后,我又点样检测大小,还是正确的。所以应该排除前两段的问题了。 第四,我用了两种方法进行搭桥,一种是先延伸,就是不加两端引物,p20个循环,后加入引物继续p25个循环。这是我们实验室的传统方法,但是我没有得到目的条带。我也进行了温度梯度pcr,均小于两端引物和中间重复区域的TM值。 发自小木虫Android客户端 |
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