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[求助]
求助，搭桥pcr
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我现在要搭两个前段，一个是2.3kb一个是2.4kb，有点长，现在搭桥搭不出来。 第一，因为我们是中间定点突变的，所以只能从这儿分。我们之前已经用我们的酶顺利p出了全长，所以肯定不是酶的问题了。 第二，中间大约有24个重复碱基，长度应该也够了。 第三，我们p两段的时候，还是很顺利的，也很单一。只是pcr大量的时候，我先点2微升检测，大小正确，然后把其余的一百多微升一起点往后，条带大小变小了。因此胶回收后，我又点样检测大小，还是正确的。所以应该排除前两段的问题了。 第四，我用了两种方法进行搭桥，一种是先延伸，就是不加两端引物，p20个循环，后加入引物继续p25个循环。这是我们实验室的传统方法，但是我没有得到目的条带。我也进行了温度梯度pcr，均小于两端引物和中间重复区域的TM值。 发自小木虫Android客户端 |
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两段引物，我都是加的1:1比例，因为亮度差不多。之前30微升体系我加了0.5微升，也加过0.3微升的。 现在就是只有杂带，没有目的条带。该怎么办？我已经不知道该咋办了？ 发自小木虫Android客户端 |
3楼2015-11-05 08:59:31
4楼2015-11-05 09:00:00