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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 转化涂板加kana和氨苄有区别么，还有阴性对照？
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scofield111

银虫 (正式写手)

[求助] 转化涂板加kana和氨苄有区别么，还有阴性对照？ 已有3人参与

请问为什么加入抗生素的平板，阳性克隆就能生长，还有阴性对照怎么做？是要培养的菌直接图在平板上么
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1楼 2015-11-02 17:48:53
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jeff瓜瓜

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不是加了抗生素你的班子上才长菌，抗生素的目的是为了筛选。你转化的质粒上带有相应的抗生素的抗性，能在那种抗生素存在的情况下生长，而没有转成功的则不能生长。也就是说理论上只有转进去质粒的大肠杆菌才能长在抗性板上，但是后期还需要PCR的验证
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2楼2015-11-02 18:30:05
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想学好的学渣

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好酶切验证，菌液PCR假阳性真的太高了…

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7楼2015-11-04 09:44:06
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jeff瓜瓜

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by scofield111 at 2015-11-04 00:25:31
那就是菌落pcr了？引物用我扩增目的片段的设计的引物是吧？
...

最好用载体引物，按我师兄的说法就是：可能你在涂板的时候会有没转进去的，或没连接上的片段，可能隐藏在某个菌落下面，你在点菌的时候刚好带进去这个没转进去的质粒或者片段，然后你用片顿引物的时候就能以这个为模板P出类似目的条带的假阳性。楼下也说到了酶切验证比PCR要好，但是我们实验室一般都是PCR看有差不多大小的片段就直接送测序了。。。所以一般不酶切验证，你结合自己的实际情况看吧
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8楼2015-11-04 10:22:42
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liping121200

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
氨苄和卡那都是根据你载体上的筛选基因来定的，阳性能在相应抗生素的平板上生长，菌液pcr可以作为一定程度的参考，但是对于要求高的，最好做个酶切鉴定，反正最后都要送测序，测序最能说明问题。
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好好学习，天天向上
9楼2015-11-04 12:11:13
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普通回帖

lihanxuan93

铁杆木虫 (知名作家)
～～

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3楼2015-11-02 18:46:59
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scofield111

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jeff瓜瓜 at 2015-11-02 18:30:05
不是加了抗生素你的班子上才长菌，抗生素的目的是为了筛选。你转化的质粒上带有相应的抗生素的抗性，能在那种抗生素存在的情况下生长，而没有转成功的则不能生长。也就是说理论上只有转进去质粒的大肠杆菌才能长在抗 ...

后期做菌落pcr验证是么

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4楼2015-11-03 00:09:23
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jeff瓜瓜

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by scofield111 at 2015-11-03 00:09:23
后期做菌落pcr验证是么
...

用合适的引物去PCR看看能不能P出自己要的片段，这样才能确定是否真的转进去了
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5楼2015-11-03 12:40:46
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scofield111

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jeff瓜瓜 at 2015-11-03 12:40:46
用合适的引物去PCR看看能不能P出自己要的片段，这样才能确定是否真的转进去了...

那就是菌落pcr了？引物用我扩增目的片段的设计的引物是吧？

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6楼2015-11-04 00:25:31
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scofield111

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jeff瓜瓜 at 2015-11-04 10:22:42
最好用载体引物，按我师兄的说法就是：可能你在涂板的时候会有没转进去的，或没连接上的片段，可能隐藏在某个菌落下面，你在点菌的时候刚好带进去这个没转进去的质粒或者片段，然后你用片顿引物的时候就能以这个为 ...

嗯，谢谢，打算酶切验证测序

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10楼2015-11-05 10:21:11
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