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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 构建表达载体后发现有移码，后修改没有成功
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霜落雪

铁虫 (初入文坛)

[求助] 构建表达载体后发现有移码，后修改没有成功 已有1人参与

我用PCDNA构建的表达载体，在ECOR1和NOT1中间插入基因片段，第一次构建出的表达载体测序发现NOT1的GCGGCCGC序列变成了AGCGGCCGCA，（前面的A是我本来为了防止移码加上的，后面的A是以前别人用这个质粒时加在后面的基因上的我一开始没有发现）。总之多了一个碱基，之后想修改，就把下游引物上我加入的T给去了，然后重新构建，结果第二次测序结果出来跟第一次是一样的，还是AGCGGCCGCA。。不知道出了什么问题呢？还是我用的方法不对，不应该这么修改呢？求大神~~
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1楼 2015-11-01 19:04:52
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latitudezy

新虫 (小有名气)
用什么DNA聚合酶跑地呢？

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2楼2015-11-01 19:27:57
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霜落雪

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by latitudezy at 2015-11-01 19:27:57
用什么DNA聚合酶跑地呢？

用的rTaq酶
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3楼2015-11-01 19:29:57
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latitudezy

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-11-02 22:28:54
taq酶会加A么，多测几个吧

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4楼2015-11-01 20:20:12
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霜落雪

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by latitudezy at 2015-11-01 20:20:12
taq酶会加A么，多测几个吧

跟Taq酶有关系么？
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5楼2015-11-01 20:30:19
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latitudezy

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 霜落雪 at 2015-11-01 20:30:19
跟Taq酶有关系么？...

用T载体做克隆时，不就是利用taq酶跑pcr加A的原理吗？我一般构建载体时会多挑几个克隆去测序

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6楼2015-11-02 00:28:17
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霜落雪

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by latitudezy at 2015-11-02 00:28:17
用T载体做克隆时，不就是利用taq酶跑pcr加A的原理吗？我一般构建载体时会多挑几个克隆去测序
...

我查了一下Taq酶加A不是在整个序列的3'末端加A么，会在中间加么？我主要是这次挑了48个斑只有这一个样片段大小对了，其他的双酶切后都没连接上，所以再测就还是得重新做，但是现在不明白问题在哪里。
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7楼2015-11-02 09:46:20
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
怀疑是你的引物设计有问题，能把你的引物序列发上来看看吗？
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8楼2015-11-02 11:09:32
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霜落雪

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ganchao1776 at 2015-11-02 11:09:32
怀疑是你的引物设计有问题，能把你的引物序列发上来看看吗？

第一次的下游引物是ATAAGAATGCGGCCGCTACCAATGAAGTTA
第二次是ATAAGAATGCGGCCGCACCAATGAAGTTA
拜托帮我看看~~
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9楼2015-11-02 12:13:42
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 霜落雪 at 2015-11-02 12:13:42
第一次的下游引物是ATAAGAATGCGGCCGCTACCAATGAAGTTA
第二次是ATAAGAATGCGGCCGCACCAATGAAGTTA
拜托帮我看看~~...

你这个是出现在基困的下游，移码对翻译有影响吗？
我也没有搞明白你这个是出了什么问题呀！！
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10楼2015-11-02 13:24:05
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